梅嘉洺++黃小霞++王詠+朱美蘭++林輝++陽宴清+盧運(yùn)海

摘 要 根據(jù)近緣種間同源基因序列保守的原理，設(shè)計(jì)20對(duì)可用于擴(kuò)增菌草PEPC基因的特異性PCR反應(yīng)引物。利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)46份菌草種質(zhì)資源進(jìn)行PEPC基因多樣性分析。結(jié)果表明：12對(duì)引物可對(duì)供試材料實(shí)現(xiàn)有效特異性擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Hae III酶切，在46份材料上共給出176（平均每對(duì)引物14.7）個(gè)變異類型。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，材料間遺傳相似系數(shù)（SM）在0.86～1，在遺傳相似系數(shù)為0.865時(shí)，46份材料可分為四大類群，這表明PCR-RFLP技術(shù)可有效用于菌草資源的遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞 菌草 ；PCR-RFLP ；種質(zhì)資源 ；PEPC 基因 ；遺傳多樣性

分類號(hào) S567.2

Polymorphism Analysis of PEPC Gene Family among

46 Juncao Germplasms by PCR-RFLP

MEI Jiaming1，2） HUANG Xiaoxia1，2） WANG Yong1，2）

ZHU Meilan1，2） LIN Hui2） YANG Yanqing1） LU Yunhai1）

（1 College of Crop Science， Fujian Agriculture and Forestry University，

Fuzhou， Fujian 350002；

2 National Engineering Research Center of JUNCAO Technology， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract A total of 20 pairs of specific primers were designed to amplify the phosphoenolpyruvate carboxylase （PEPC） gene family of JUNCAO germplasms. PCR-Restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） technique was applied to study the polymorphism of PEPC gene family among 46 JUNCAO germplasms. The results showed that 12 of 20 primer pairs gave good amplification patterns， and digestion of these PCR products by Hae III gave a total of 176 （14.7 per primer pair in average） different patterns among 46 JUNCAO germplasms. The genetic similarity coefficient （SM） among all accessions was ranged from 0.86 to 1. The 46 JUNCAO germplasms were clustered into 4 groups by UPGMA when genetic similarity coefficient was 0.865. The study indicated that PCR-RFLP technique could be efficiently used for analysis of genetic diversity of JUNCAO germplasms.

Keywords JUNCAO ； PCR-RFLP ； germplasm ； PEPC gene ； genetic polymorphism

菌草（JUNCAO）是指可用于栽培食用菌、藥用菌培養(yǎng)基的草本植物[1]，它既包括芒萁、五節(jié)芒、類蘆、蘆竹、蘆葦?shù)纫吧牟荼局参?，也包括巨菌草、象草、紫象草、香根草、紫花苜蓿、串葉草、綠洲系列蘆竹等人工栽培的草本植物，廣義的菌草還包括玉米、高粱、甘蔗等作物的莖葉。隨著菌草技術(shù)（運(yùn)用菌草栽培食用菌、藥用菌和生產(chǎn)菌物飼料、菌物肥料的綜合技術(shù)）的不斷完善和菌草產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，有關(guān)菌草種質(zhì)資源的收集、保存、鑒定和利用工作變得越來越迫切和重要。但由于可用作菌草的植物種類繁多、來源多樣，使得菌草種質(zhì)資源管理存在一定的盲目性和重復(fù)性。因而從分子水平上研究菌草種質(zhì)資源的遺傳多樣性及建立菌草種質(zhì)分子鑒定技術(shù)非常重要。

C4植物的CO2固定效率比C3植物高很多，原因是C4植物的葉肉細(xì)胞中含有獨(dú)特的酶，即磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC4.1.131），它是C4植物光合作用過程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，使得由氣孔進(jìn)入空氣中的CO2首先被一種三碳化合物——磷酸烯醇式丙酮酸同化，形成四碳化合物草酰乙酸，后者經(jīng)葉綠體中的蘋果酸脫氫酶進(jìn)而被還原為蘋果酸，進(jìn)入維管束鞘，再分解釋放出CO2和一個(gè)三碳分子——丙酮酸；CO2進(jìn)入C3（卡爾文）循環(huán)被1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubusco）固定，而丙酮酸則重新被運(yùn)回葉肉細(xì)胞的葉綠體內(nèi)，在磷酸丙酮酸二激酶的催化下形成CO2受體磷酸烯醇式丙酮酸（圖1）。因此，C4植物可在夜晚開放氣孔吸收CO2并合成C4化合物，再在白天有陽光時(shí)借助C4化合物提供的CO2合成有機(jī)物，有利于植物在干旱、低溫的環(huán)境下保持較高的生物產(chǎn)量[3]。PEPC廣泛存在于光合生物（如植物、藻類、藍(lán)細(xì)胞和光合細(xì)胞）、非光合細(xì)菌及原生動(dòng)物中[4]。編碼該酶的基因在甘蔗[5-6]、玉米[7-8]、高粱[9]等C4植物、其它CAM植物及C3植物中被相繼克隆并被詳細(xì)研究[10]。在這些植物中都存在著3～4個(gè)編碼PEPC的小基因家族，每個(gè)家族可包含1至多個(gè)基因成員，它們的序列在不同植物之間存在著一定的保守性[2，11-12]。endprint

本研究利用近緣植物中同源基因序列保守的原理，對(duì)高粱、玉米、水稻、甘蔗等植物中已知PEPC基因序列進(jìn)行采集、分析和序列比對(duì)，在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性PCR引物，繼而用來擴(kuò)增不同菌草種質(zhì)資源中的PEPC基因片段，結(jié)合PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶Hae III酶切，分析其多樣性，為科菌草種質(zhì)資源的分類鑒定及評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的46個(gè)菌草材料取自福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心設(shè)立在福州的種質(zhì)資源圃（表1）。于2014年秋季采集各品種（系）幼嫩葉片，裝入編號(hào)袋，保存于-80℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和檢測(cè)

采用改良CTAB法提取基因組DNA[9]，然后進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的質(zhì)量，并在Nanodrop 2000（Thermo Fisher）分光光度計(jì)上測(cè)定DNA樣品的濃度。先將濃度稀釋至100 ng/mL母液，再取少量配制成濃度為20 ng/mL的備用液。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

高粱、玉米、水稻、甘蔗等植物的完整PEPC基因序列（mRNA及DNA序列）來自于網(wǎng)上NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），主要有5個(gè)高粱序列（Sb02g021090、Sb03g035090、Sb04g008720、Sb07g014960、Sb10g021330）、5個(gè)玉米序列（NM_001111968、XM_008657117、NM_001112033、NM_001111948、NM_001112033）、5個(gè)水稻序列（AK242583、Os01g0208700、Os01g0758300、Os02g0244700、Os08g0366000）和1個(gè)甘蔗序列（M86661）。利用CLUSTALW軟件進(jìn)行序列分析和比對(duì)，找出序列之間的保守和差異區(qū)域；借助于在線Primer3.0Plus軟件（http：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/

primer3plus.cgi），在序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性PCR引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。設(shè)計(jì)的引物預(yù)擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度在700～1 500 bp。其中用于本研究的12對(duì)引物名稱及序列見表2。

1.2.3 PCR-RFLP分析

PCR反應(yīng)總體積為20 μL，其中包括DNA模板（20 ng/μL）2 μL，正向引物（10 μmol/L）1 μL，反向引物（10 μmol/L）1 μL，2xTaq PCR Starmix （GenStar）10 μL，ddH2O 6.0 μL。所用試劑購自北京康潤(rùn)誠生物技術(shù)有限公司。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；隨后72℃延伸7 min，最后4℃恒溫保存。首先取5 μL PCR擴(kuò)增液，在1.0%瓊脂糖、TAEx1、120 V條件下電泳30 min，在凝膠成像儀（伯樂）上觀察結(jié)果并拍照。然后取10 μL PCR擴(kuò)增液，加入1 U的Hae III酶和1xBuffer（寶生物工程有限公司），用ddH2O補(bǔ)至20 μL，放置在37℃恒溫箱處理90 min，在1.5%瓊脂糖、TAEx1、110 V條件下電泳30 min，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

針對(duì)每一對(duì)特異性引物，首先對(duì)其在46個(gè)菌草材料上PCR產(chǎn)物的Hae III酶切電泳圖譜進(jìn)行整體分析比較，鑒定出存在與該46個(gè)菌草材料中間的所有變異類型，依次被命名為A、B、C、D、E、F等。然后針對(duì)每個(gè)變異類型（可被看作一個(gè)分子標(biāo)記）統(tǒng)計(jì)其在46個(gè)菌草材料中的分布情況：屬于該變異類型的記為1，不屬于該變異類型的記為0，根據(jù)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果建立原始數(shù)據(jù)（0，1）矩陣。利用NTSYS-pc 2.1軟件中的子程序SIMQUAL對(duì)矩陣進(jìn)行樣本間的相似性系數(shù)（SM）計(jì)算，然后用子程序SAHN中的非加權(quán)類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，最后用Tree plot繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR引物的篩選

針對(duì)PEPC基因家族的各個(gè)成員基因及每個(gè)成員基因的不同區(qū)域，總共設(shè)計(jì)了20對(duì)引物。這些引物合成后首先在8個(gè)菌草種質(zhì)材料上進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)（圖2），其中12對(duì)引物能夠在8個(gè)材料上擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定的條帶（如圖2中的PEPC01-PEPC05所示），而其余8對(duì)引物則給出了不穩(wěn)定的擴(kuò)增結(jié)果（如圖2中的PEPC13所示）。

2.2 遺傳多樣性分析

利用篩選出的12對(duì)引物對(duì)46份菌草種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Hae III酶切及瓊脂糖電泳，結(jié)果共鑒定出176個(gè)變異類型（限制性內(nèi)切酶Hae III酶切電泳譜類型），每對(duì)引物給出10～17（平均為14.7）個(gè)變異類型。引物PEPC03在46份菌草種質(zhì)材料上的PCR-RFLP分析結(jié)果見圖3。

2.3 菌草種質(zhì)的聚類分析

對(duì)46份菌草種質(zhì)材料的PCR-RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，聚類結(jié)果見圖4。由圖4可知，供試材料之間的遺傳相似性系數(shù)（SM）分布在0.86～1，在遺傳相似系數(shù)為0.865時(shí)，可將46份菌草種質(zhì)材料分成I、II、III、IV共四大類群。

第I類群中包括了26份種質(zhì)，是最大的一個(gè)類群，并且所有材料均屬于狼尾草屬（Pennisetum）植物；其中有3對(duì)種質(zhì)材料（海南象草和細(xì)莖象草、漳州象草和熱研4號(hào)粗莖象草、臺(tái)灣甜草和高丹草變種）之間的遺傳相似系數(shù)為1，說明它們的親緣關(guān)系很近，現(xiàn)有數(shù)據(jù)無法將它們區(qū)分開來；8195象草、狼尾草和美洲狼尾草3個(gè)材料和其余的23份材料之間有著明顯的遺傳差異，后者明顯可進(jìn)一步分成幾個(gè)小組。endprint

第II類群包括了高粱屬（Sorghum）、甘蔗屬（Saccharum）、薏苡屬（Coix）等10份材料，材料之間的遺傳多樣性比較大（相對(duì)于第I類），10份材料均被區(qū)分開來。

第III類群包括了所有蘆竹屬（Arundo）的8份材料，其中綠洲3號(hào)和綠洲6號(hào)與其余4份材料明顯區(qū)分開來，說明它們之間的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，8份材料均被區(qū)分開來。

第IV類群包括了分別屬于類蘆屬（Phragmitas）和類蘆屬（Neyraudia）的2份材料，兩者之間的差異距離相對(duì)較大，相似系數(shù)為0.88。

3 討論與結(jié)論

PCR-RFLP技術(shù)利用特異性PCR引物擴(kuò)增樣本中有關(guān)細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)DNA上的特定基因區(qū)域，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶酶切，結(jié)合電泳分析來檢測(cè)該基因區(qū)域內(nèi)在供試樣本之間的遺傳變異情況。該技術(shù)省時(shí)、高效、低成本，已經(jīng)被成功用于針葉樹[14]、橡樹[15]、甘藍(lán)[16]、木瓜[17]、桑樹[18]等植物來開展遺傳多樣性分析、分子進(jìn)化樹構(gòu)建等研究工作，也被作為一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)來鑒別咖啡的種類[19]。

隨著菌草產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，菌草的種質(zhì)資源收集工作越來越受到重視[1]。但由于可作為菌草的植物種類繁多、地理來源廣泛，目前在種質(zhì)資源的鑒定、保存、管理和利用等多個(gè)環(huán)節(jié)上還存在著許多盲目性。本研究在46份菌草種質(zhì)材料上使用PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)特異于C4植物光合作用過程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶PEPC基因家族的不同成員基因進(jìn)行了多樣性分析，篩選出了12對(duì)擴(kuò)增效果好的PEPC基因特異性PCR引物。聚類分析結(jié)果將46份菌草種質(zhì)材料清楚的分成4大類群，其中的第I大類群包括了供試材料中的所有26份狼尾草屬材料，并且可進(jìn)一步分成幾個(gè)小組。第III大類群包括了所有的8份蘆竹屬材料，第II大類群包括了多個(gè)屬的植物，而第IV大類群卻包括了2個(gè)屬的2份種質(zhì)。這些結(jié)果雖然還不夠完善，但為菌草種質(zhì)資源的鑒定提供了初步的分子依據(jù)和技術(shù)手段，未來渴望將該項(xiàng)技術(shù)在菌草上進(jìn)一步推廣，同時(shí)還可以結(jié)合采用其它技術(shù)，如ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）[20]、SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism）[21]、iPBS（inter Primer Binding Site）[22]等，通過分析更多的菌草種質(zhì)材料，以獲得更加全面的聚類分析結(jié)果，為菌草種質(zhì)資源的收集、管理和利用提供參考和指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)

[1] 林占熺. 菌草學(xué)（第三版）[M]. 北京：國(guó)家行政學(xué)院出版社，2013.

[2] Wang X， Gowik U， Tang H， et al. Comparative genomic analysis of C4 photosynthetic pathway evolution in grasses[J]. Genome Biol， 2009， 10（6）： R68.

[3] 焦進(jìn)安. 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的多生理功能[J]. 植物生理學(xué)通訊，1987，37（1）：40-43.

[4] Izui K， Matsumura H， Furumoto T， et al. Phosphoenolpyruvate carboxylase：a new era of structural biology[J]. Annu Rev Plant Biol， 2004， 55（1）： 69-84.

[5] Albert H A， Martin T， Sun S S. Structure and expression of a sugarcane gene encoding a housekeeping phosphoenolpyruvate carboxylase[J]. Plant Mol Biol， 1992， 20（4）：663-671.

[6] Besnard G， Pincon G， D'Hont A， et al. Characterisation of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene family in sugarcane（Saccharum spp.）[J]. Theor Appl Genet， 2003， 107（3）：470-478.

[7] Harpster M H， Taylor W C. Maize phosphoenolpyruvate carboxylase. Cloning and characterization of mRNAs encoding isozymic forms[J]. J Biol Chem， 1986， 261（13）：6 132-6 136.

[8] Matsuoka M， Minami E. Complete structure of the gene for phosphoenolpyruvate carboxylase from maize[J]. Eur J Biochem， 1989， 181（3）：593-598.

[9] Lepiniec L， Keryer E， Tagu D， et al. Complete nucleotide sequence of a sorghum gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxylase involved in C4 photosynthesis[J]. Plant Mol Biol， 1992， 19（2）：339-342.

[10] 魏紹巍，黎 茵. 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能及其在基因工程中的應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2011，27（12）：1 702-1 710.endprint

[11] 趙 艷，陳麗梅，李昆志. 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2007，5（1）：9-13.

[12] Christin P A， Arakaki M， Osborne C P， et al. Shared origins of a key enzyme during the evolution of C4 and CAM metabolism[J]. J Exp Bot， 2014， 65（13）： 3 609-3 621.

[13] Murray H G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight DNA[J]. Nucleic Acids Research， 1980， 8（12）： 4 321-4 325.

[14] Tsumura Y， Yoshimura K， Tomaru N， et al. Molecular phylogeny of conifers using RFLP analysis of PCR-amplified specific chloroplast genes[J]. Theor Appl Genet， 1995， 91（7）： 1 222-1 236.

[15] Dumolin S， Demesure B， Petit R J. Inheritance of chloroplast and mitochondrial genomes in pedunculate oak investigated with an efficient PCR method[J]. Theor Appl Genet， 1995， 91（7）： 1 253-1 256.

[16] Panda S， Martín J P， Aguinagalde I. Chloroplast and nuclear DNA studies in a few members of the Brassica oleracea L. group using PCR-RFLP and ISSR-PCR markers： a population genetic analysis[J]. Theor Appl Genet， 2003， 106（6）： 1 122-1 128.

[17] van Droogenbroeck B， Kyndt T， Maertens I， et al. Phylogenetic analysis of the highland papayas（Vasconcellea）and allied genera（Caricaceae）using PCR-RFLP[J]. Theor Appl Genet， 2004， 108（8）： 1 473-1 486.

[18] Hu D， Zhang P， Sun Y L， et al. Genetic relationship in mulberry（Morus L.）inferred through PCR-RFLP and trnD-trnT sequence data of chloroplast DNA[J]. Biotechnol Biotechnol Equip， 2014， 28（3）： 425-430.

[19] Spaniolas S， May S T， Bennett M J， et al. Authentication of coffee by means of PCR-RFLP analysis and lab-on-a-chip capillary electrophoresis[J]. J Agric Food Chem， 2006， 54（20）： 7 466-7 470.endprint