梅嘉洺++黃小霞++王詠+朱美蘭++林輝++陽宴清+盧運海

摘 要 根據(jù)近緣種間同源基因序列保守的原理，設(shè)計20對可用于擴增菌草PEPC基因的特異性PCR反應(yīng)引物。利用PCR-RFLP技術(shù)對46份菌草種質(zhì)資源進行PEPC基因多樣性分析。結(jié)果表明：12對引物可對供試材料實現(xiàn)有效特異性擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Hae III酶切，在46份材料上共給出176（平均每對引物14.7）個變異類型。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，材料間遺傳相似系數(shù)（SM）在0.86～1，在遺傳相似系數(shù)為0.865時，46份材料可分為四大類群，這表明PCR-RFLP技術(shù)可有效用于菌草資源的遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞 菌草 ；PCR-RFLP ；種質(zhì)資源 ；PEPC 基因 ；遺傳多樣性

分類號 S567.2

Polymorphism Analysis of PEPC Gene Family among

46 Juncao Germplasms by PCR-RFLP

MEI Jiaming1，2） HUANG Xiaoxia1，2） WANG Yong1，2）

ZHU Meilan1，2） LIN Hui2） YANG Yanqing1） LU Yunhai1）

（1 College of Crop Science， Fujian Agriculture and Forestry University，

Fuzhou， Fujian 350002；

2 National Engineering Research Center of JUNCAO Technology， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract A total of 20 pairs of specific primers were designed to amplify the phosphoenolpyruvate carboxylase （PEPC） gene family of JUNCAO germplasms. PCR-Restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） technique was applied to study the polymorphism of PEPC gene family among 46 JUNCAO germplasms. The results showed that 12 of 20 primer pairs gave good amplification patterns， and digestion of these PCR products by Hae III gave a total of 176 （14.7 per primer pair in average） different patterns among 46 JUNCAO germplasms. The genetic similarity coefficient （SM） among all accessions was ranged from 0.86 to 1. The 46 JUNCAO germplasms were clustered into 4 groups by UPGMA when genetic similarity coefficient was 0.865. The study indicated that PCR-RFLP technique could be efficiently used for analysis of genetic diversity of JUNCAO germplasms.

Keywords JUNCAO ； PCR-RFLP ； germplasm ； PEPC gene ； genetic polymorphism

菌草（JUNCAO）是指可用于栽培食用菌、藥用菌培養(yǎng)基的草本植物[1]，它既包括芒萁、五節(jié)芒、類蘆、蘆竹、蘆葦?shù)纫吧牟荼局参铮舶ň蘧?、象草、紫象草、香根草、紫花苜蓿、串葉草、綠洲系列蘆竹等人工栽培的草本植物，廣義的菌草還包括玉米、高粱、甘蔗等作物的莖葉。隨著菌草技術(shù)（運用菌草栽培食用菌、藥用菌和生產(chǎn)菌物飼料、菌物肥料的綜合技術(shù)）的不斷完善和菌草產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，有關(guān)菌草種質(zhì)資源的收集、保存、鑒定和利用工作變得越來越迫切和重要。但由于可用作菌草的植物種類繁多、來源多樣，使得菌草種質(zhì)資源管理存在一定的盲目性和重復(fù)性。因而從分子水平上研究菌草種質(zhì)資源的遺傳多樣性及建立菌草種質(zhì)分子鑒定技術(shù)非常重要。

C4植物的CO2固定效率比C3植物高很多，原因是C4植物的葉肉細胞中含有獨特的酶，即磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC4.1.131），它是C4植物光合作用過程中的第一個關(guān)鍵酶，使得由氣孔進入空氣中的CO2首先被一種三碳化合物——磷酸烯醇式丙酮酸同化，形成四碳化合物草酰乙酸，后者經(jīng)葉綠體中的蘋果酸脫氫酶進而被還原為蘋果酸，進入維管束鞘，再分解釋放出CO2和一個三碳分子——丙酮酸；CO2進入C3（卡爾文）循環(huán)被1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubusco）固定，而丙酮酸則重新被運回葉肉細胞的葉綠體內(nèi)，在磷酸丙酮酸二激酶的催化下形成CO2受體磷酸烯醇式丙酮酸（圖1）。因此，C4植物可在夜晚開放氣孔吸收CO2并合成C4化合物，再在白天有陽光時借助C4化合物提供的CO2合成有機物，有利于植物在干旱、低溫的環(huán)境下保持較高的生物產(chǎn)量[3]。PEPC廣泛存在于光合生物（如植物、藻類、藍細胞和光合細胞）、非光合細菌及原生動物中[4]。編碼該酶的基因在甘蔗[5-6]、玉米[7-8]、高粱[9]等C4植物、其它CAM植物及C3植物中被相繼克隆并被詳細研究[10]。在這些植物中都存在著3～4個編碼PEPC的小基因家族，每個家族可包含1至多個基因成員，它們的序列在不同植物之間存在著一定的保守性[2，11-12]。endprint

本研究利用近緣植物中同源基因序列保守的原理，對高粱、玉米、水稻、甘蔗等植物中已知PEPC基因序列進行采集、分析和序列比對，在基因保守區(qū)域設(shè)計特異性PCR引物，繼而用來擴增不同菌草種質(zhì)資源中的PEPC基因片段，結(jié)合PCR-RFLP技術(shù)，對獲得的PCR產(chǎn)物進行限制性核酸內(nèi)切酶Hae III酶切，分析其多樣性，為科菌草種質(zhì)資源的分類鑒定及評價提供理論依據(jù)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的46個菌草材料取自福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心設(shè)立在福州的種質(zhì)資源圃（表1）。于2014年秋季采集各品種（系）幼嫩葉片，裝入編號袋，保存于-80℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和檢測

采用改良CTAB法提取基因組DNA[9]，然后進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的質(zhì)量，并在Nanodrop 2000（Thermo Fisher）分光光度計上測定DNA樣品的濃度。先將濃度稀釋至100 ng/mL母液，再取少量配制成濃度為20 ng/mL的備用液。

1.2.2 引物設(shè)計

高粱、玉米、水稻、甘蔗等植物的完整PEPC基因序列（mRNA及DNA序列）來自于網(wǎng)上NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），主要有5個高粱序列（Sb02g021090、Sb03g035090、Sb04g008720、Sb07g014960、Sb10g021330）、5個玉米序列（NM_001111968、XM_008657117、NM_001112033、NM_001111948、NM_001112033）、5個水稻序列（AK242583、Os01g0208700、Os01g0758300、Os02g0244700、Os08g0366000）和1個甘蔗序列（M86661）。利用CLUSTALW軟件進行序列分析和比對，找出序列之間的保守和差異區(qū)域；借助于在線Primer3.0Plus軟件（http：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/

primer3plus.cgi），在序列保守區(qū)域設(shè)計特異性PCR引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。設(shè)計的引物預(yù)擴增的片段長度在700～1 500 bp。其中用于本研究的12對引物名稱及序列見表2。

1.2.3 PCR-RFLP分析

PCR反應(yīng)總體積為20 μL，其中包括DNA模板（20 ng/μL）2 μL，正向引物（10 μmol/L）1 μL，反向引物（10 μmol/L）1 μL，2xTaq PCR Starmix （GenStar）10 μL，ddH2O 6.0 μL。所用試劑購自北京康潤誠生物技術(shù)有限公司。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；隨后72℃延伸7 min，最后4℃恒溫保存。首先取5 μL PCR擴增液，在1.0%瓊脂糖、TAEx1、120 V條件下電泳30 min，在凝膠成像儀（伯樂）上觀察結(jié)果并拍照。然后取10 μL PCR擴增液，加入1 U的Hae III酶和1xBuffer（寶生物工程有限公司），用ddH2O補至20 μL，放置在37℃恒溫箱處理90 min，在1.5%瓊脂糖、TAEx1、110 V條件下電泳30 min，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計分析

針對每一對特異性引物，首先對其在46個菌草材料上PCR產(chǎn)物的Hae III酶切電泳圖譜進行整體分析比較，鑒定出存在與該46個菌草材料中間的所有變異類型，依次被命名為A、B、C、D、E、F等。然后針對每個變異類型（可被看作一個分子標記）統(tǒng)計其在46個菌草材料中的分布情況：屬于該變異類型的記為1，不屬于該變異類型的記為0，根據(jù)統(tǒng)計的結(jié)果建立原始數(shù)據(jù)（0，1）矩陣。利用NTSYS-pc 2.1軟件中的子程序SIMQUAL對矩陣進行樣本間的相似性系數(shù)（SM）計算，然后用子程序SAHN中的非加權(quán)類平均法（UPGMA）進行聚類分析，最后用Tree plot繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR引物的篩選

針對PEPC基因家族的各個成員基因及每個成員基因的不同區(qū)域，總共設(shè)計了20對引物。這些引物合成后首先在8個菌草種質(zhì)材料上進行擴增實驗（圖2），其中12對引物能夠在8個材料上擴增出清晰、穩(wěn)定的條帶（如圖2中的PEPC01-PEPC05所示），而其余8對引物則給出了不穩(wěn)定的擴增結(jié)果（如圖2中的PEPC13所示）。

2.2 遺傳多樣性分析

利用篩選出的12對引物對46份菌草種質(zhì)材料進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行Hae III酶切及瓊脂糖電泳，結(jié)果共鑒定出176個變異類型（限制性內(nèi)切酶Hae III酶切電泳譜類型），每對引物給出10～17（平均為14.7）個變異類型。引物PEPC03在46份菌草種質(zhì)材料上的PCR-RFLP分析結(jié)果見圖3。

2.3 菌草種質(zhì)的聚類分析

對46份菌草種質(zhì)材料的PCR-RFLP數(shù)據(jù)進行UPGMA聚類分析，聚類結(jié)果見圖4。由圖4可知，供試材料之間的遺傳相似性系數(shù)（SM）分布在0.86～1，在遺傳相似系數(shù)為0.865時，可將46份菌草種質(zhì)材料分成I、II、III、IV共四大類群。

第I類群中包括了26份種質(zhì)，是最大的一個類群，并且所有材料均屬于狼尾草屬（Pennisetum）植物；其中有3對種質(zhì)材料（海南象草和細莖象草、漳州象草和熱研4號粗莖象草、臺灣甜草和高丹草變種）之間的遺傳相似系數(shù)為1，說明它們的親緣關(guān)系很近，現(xiàn)有數(shù)據(jù)無法將它們區(qū)分開來；8195象草、狼尾草和美洲狼尾草3個材料和其余的23份材料之間有著明顯的遺傳差異，后者明顯可進一步分成幾個小組。endprint

第II類群包括了高粱屬（Sorghum）、甘蔗屬（Saccharum）、薏苡屬（Coix）等10份材料，材料之間的遺傳多樣性比較大（相對于第I類），10份材料均被區(qū)分開來。

第III類群包括了所有蘆竹屬（Arundo）的8份材料，其中綠洲3號和綠洲6號與其余4份材料明顯區(qū)分開來，說明它們之間的遺傳距離相對較遠，8份材料均被區(qū)分開來。

第IV類群包括了分別屬于類蘆屬（Phragmitas）和類蘆屬（Neyraudia）的2份材料，兩者之間的差異距離相對較大，相似系數(shù)為0.88。

3 討論與結(jié)論

PCR-RFLP技術(shù)利用特異性PCR引物擴增樣本中有關(guān)細胞核或細胞質(zhì)DNA上的特定基因區(qū)域，再對擴增產(chǎn)物進行限制性核酸內(nèi)切酶酶切，結(jié)合電泳分析來檢測該基因區(qū)域內(nèi)在供試樣本之間的遺傳變異情況。該技術(shù)省時、高效、低成本，已經(jīng)被成功用于針葉樹[14]、橡樹[15]、甘藍[16]、木瓜[17]、桑樹[18]等植物來開展遺傳多樣性分析、分子進化樹構(gòu)建等研究工作，也被作為一項檢測技術(shù)來鑒別咖啡的種類[19]。

隨著菌草產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，菌草的種質(zhì)資源收集工作越來越受到重視[1]。但由于可作為菌草的植物種類繁多、地理來源廣泛，目前在種質(zhì)資源的鑒定、保存、管理和利用等多個環(huán)節(jié)上還存在著許多盲目性。本研究在46份菌草種質(zhì)材料上使用PCR-RFLP技術(shù)，對特異于C4植物光合作用過程中的第一個關(guān)鍵酶PEPC基因家族的不同成員基因進行了多樣性分析，篩選出了12對擴增效果好的PEPC基因特異性PCR引物。聚類分析結(jié)果將46份菌草種質(zhì)材料清楚的分成4大類群，其中的第I大類群包括了供試材料中的所有26份狼尾草屬材料，并且可進一步分成幾個小組。第III大類群包括了所有的8份蘆竹屬材料，第II大類群包括了多個屬的植物，而第IV大類群卻包括了2個屬的2份種質(zhì)。這些結(jié)果雖然還不夠完善，但為菌草種質(zhì)資源的鑒定提供了初步的分子依據(jù)和技術(shù)手段，未來渴望將該項技術(shù)在菌草上進一步推廣，同時還可以結(jié)合采用其它技術(shù)，如ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）[20]、SRAP（Sequence Related Amplified Polymorphism）[21]、iPBS（inter Primer Binding Site）[22]等，通過分析更多的菌草種質(zhì)材料，以獲得更加全面的聚類分析結(jié)果，為菌草種質(zhì)資源的收集、管理和利用提供參考和指導(dǎo)。

參考文獻

[1] 林占熺. 菌草學(xué)（第三版）[M]. 北京：國家行政學(xué)院出版社，2013.

[2] Wang X， Gowik U， Tang H， et al. Comparative genomic analysis of C4 photosynthetic pathway evolution in grasses[J]. Genome Biol， 2009， 10（6）： R68.

[3] 焦進安. 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的多生理功能[J]. 植物生理學(xué)通訊，1987，37（1）：40-43.

[4] Izui K， Matsumura H， Furumoto T， et al. Phosphoenolpyruvate carboxylase：a new era of structural biology[J]. Annu Rev Plant Biol， 2004， 55（1）： 69-84.

[5] Albert H A， Martin T， Sun S S. Structure and expression of a sugarcane gene encoding a housekeeping phosphoenolpyruvate carboxylase[J]. Plant Mol Biol， 1992， 20（4）：663-671.

[6] Besnard G， Pincon G， D'Hont A， et al. Characterisation of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene family in sugarcane（Saccharum spp.）[J]. Theor Appl Genet， 2003， 107（3）：470-478.

[7] Harpster M H， Taylor W C. Maize phosphoenolpyruvate carboxylase. Cloning and characterization of mRNAs encoding isozymic forms[J]. J Biol Chem， 1986， 261（13）：6 132-6 136.

[8] Matsuoka M， Minami E. Complete structure of the gene for phosphoenolpyruvate carboxylase from maize[J]. Eur J Biochem， 1989， 181（3）：593-598.

[9] Lepiniec L， Keryer E， Tagu D， et al. Complete nucleotide sequence of a sorghum gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxylase involved in C4 photosynthesis[J]. Plant Mol Biol， 1992， 19（2）：339-342.

[10] 魏紹巍，黎 茵. 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能及其在基因工程中的應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報，2011，27（12）：1 702-1 710.endprint

[11] 趙 艷，陳麗梅，李昆志. 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子結(jié)構(gòu)研究進展[J]. 生物技術(shù)通報，2007，5（1）：9-13.

[12] Christin P A， Arakaki M， Osborne C P， et al. Shared origins of a key enzyme during the evolution of C4 and CAM metabolism[J]. J Exp Bot， 2014， 65（13）： 3 609-3 621.

[13] Murray H G， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight DNA[J]. Nucleic Acids Research， 1980， 8（12）： 4 321-4 325.

[14] Tsumura Y， Yoshimura K， Tomaru N， et al. Molecular phylogeny of conifers using RFLP analysis of PCR-amplified specific chloroplast genes[J]. Theor Appl Genet， 1995， 91（7）： 1 222-1 236.

[15] Dumolin S， Demesure B， Petit R J. Inheritance of chloroplast and mitochondrial genomes in pedunculate oak investigated with an efficient PCR method[J]. Theor Appl Genet， 1995， 91（7）： 1 253-1 256.

[16] Panda S， Martín J P， Aguinagalde I. Chloroplast and nuclear DNA studies in a few members of the Brassica oleracea L. group using PCR-RFLP and ISSR-PCR markers： a population genetic analysis[J]. Theor Appl Genet， 2003， 106（6）： 1 122-1 128.

[17] van Droogenbroeck B， Kyndt T， Maertens I， et al. Phylogenetic analysis of the highland papayas（Vasconcellea）and allied genera（Caricaceae）using PCR-RFLP[J]. Theor Appl Genet， 2004， 108（8）： 1 473-1 486.

[18] Hu D， Zhang P， Sun Y L， et al. Genetic relationship in mulberry（Morus L.）inferred through PCR-RFLP and trnD-trnT sequence data of chloroplast DNA[J]. Biotechnol Biotechnol Equip， 2014， 28（3）： 425-430.

[19] Spaniolas S， May S T， Bennett M J， et al. Authentication of coffee by means of PCR-RFLP analysis and lab-on-a-chip capillary electrophoresis[J]. J Agric Food Chem， 2006， 54（20）： 7 466-7 470.endprint