劉 娜 董 雪 李繼耀 張國斌 高 丹 李 欣

沈陽市疾病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110031

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）屬于弧菌科弧菌屬的細(xì)菌，其作為嗜鹽細(xì)菌屬于革蘭陰性菌的一種，并且與哈氏弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌屬于同一種屬。VP 在海產(chǎn)品（如海底泥沙、海水、浮游生物和魚貝類等）和腌制食品中廣泛存在。腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心、腹部痙攣和低熱等急性胃腸炎的癥狀[1]皆可由于直接或間接食用被VP 污染的食品而引起。即使人體自身免疫系統(tǒng)可以對大部分因VP 引起的胃腸炎起到抑制作用，但仍然可以對肝病患者和免疫紊亂的群體造成生命威脅。副溶血弧菌不但能夠引起胃腸炎，還能導(dǎo)致傷口感染以及敗血癥[2]。

在世界上的所有沿海國家中發(fā)生的食源性中毒事件中由副溶血弧菌引起的占到一半以上，包括美國、日本、東南亞等沿海國家均有報(bào)道。副溶血弧菌是導(dǎo)致中國沿海地區(qū)居民夏、秋季食物中毒和急性腹瀉的主要原因。副溶血弧菌是以血清型為主要分類基礎(chǔ)的，并由菌體的抗原(O)和莢膜(K)的抗原特性所決定。副溶血弧菌的血清分型是利用O 抗原和K 抗原的組合（包括11種不同的O 抗原和65 種不同的K 抗原）來進(jìn)行分類的，針對沈陽地區(qū)副溶血弧菌血清分型資料不全面的現(xiàn)狀，該研究對沈陽市2013年5—9月食源性疾病病例監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院副溶血弧菌臨床菌株進(jìn)行血清學(xué)分型，為該地區(qū)預(yù)防副溶血弧菌感染和流行病學(xué)調(diào)查提供全面的科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

副溶血弧菌臨床菌株分離自食源性疾病病例監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院臨床病例，2013年5月—9月共采集250 份樣本，分離得到67株副溶血弧菌，采集分離時(shí)間為7—10月份。

1.2 菌株的分離培養(yǎng)

菌株的分離培養(yǎng)使用TCBS 培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、三糖鐵瓊脂，其中營養(yǎng)瓊脂和三糖鐵瓊脂分別加入3% NaCl。將采集的糞便標(biāo)本接種于37℃TCBS 瓊脂中，培養(yǎng)18～24 h，將TCBS 瓊脂上(不分解蔗糖)的透明菌落，接種于37℃三糖鐵瓊脂，同樣培養(yǎng)18～24 h，K/A，不產(chǎn)硫化氫者做O-F 試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)和耐鹽生長試驗(yàn)。發(fā)酵型、氧化酶陽性，0%NaCl 和10%NaCl 不生長、3%NaCl 和7% NaCl 生長者為副溶血弧菌疑似菌落，做系統(tǒng)生化鑒定。

表1 2013年食源性疾病監(jiān)測病例副溶血弧菌分離株API20NE 鑒定結(jié)果

1.3 生化反應(yīng)和血清分型

生化反應(yīng)用法國bioMerieux 生產(chǎn)的API20NE 生化試劑條進(jìn)行鑒定，按說明書操作。

血清分型用溶血性弧菌的血清分型診斷血清(Denka Seiken,Japan),該血清含O1～O11 共11 個(gè)O 抗原診斷血清，65 個(gè)K 抗原診斷血清。方法為取一定量細(xì)菌于3﹪NaCl 鹽水中，121℃滅菌30 min，離心(4 000 r/min,10 min），棄上清，用生理鹽水洗滌3 次。取菌體，進(jìn)行O 抗原血清凝集試驗(yàn)。K 抗原鑒定：直接取濃菌懸液與多價(jià)抗K 血清按適當(dāng)比例混合，出現(xiàn)凝集反應(yīng)時(shí)再用單個(gè)抗血清進(jìn)行檢測。用生理鹽水作為對照。

2 結(jié)果

2.1 分離副溶血性孤菌菌株的生物學(xué)性狀

分離的副溶血性弧菌67 株，均在TCBS 平板上呈綠色、中,心較深、濕潤、形態(tài)稍凸起。氧化酶陽性。在3%Nacl 雙糖鐵上－/＋，H2S－，動力+，耐鹽性試驗(yàn)：0%、10%Nacl 胨水中不生長，3%、7%Nacl 胨水中生長良好，挑取純培養(yǎng)物用API20NE 生化試劑條鑒定，結(jié)果見表1。

2.2 血清分群情況

分離的67 株副溶血性弧菌可分為5 個(gè)O 血清群，其中O3群占58.21%(39/67)、O4 群占35.82%(24/67)、O1 群占2.99%(2/67)、O2 群占1.49%(1/67)、O10 群占1.49﹪(1/67)，如圖1所示。

圖1 2013年食源性疾病監(jiān)測病例副溶血弧菌分離株血清分群

分離的67 株副溶血弧菌有77.61%(52/67)可以同時(shí)被O:K抗血清凝集，主要的血清型是O3:K6，占32.84%(22/67)，其次是O4:K68 和O4:K8，分別占13.43%(9/67)和8.96%(6/67)，約22.39%(15/67)的菌株可與O 抗血清凝集但不能與K 抗血清凝集，分別為O3:KUT 占11.94%(8/67)和O4:KUT 占10.45%(7/67)，見表2。

表2 2013年食源性疾病監(jiān)測病例副溶血弧菌分離株血清分型結(jié)果

3 討論

副溶血弧菌擁有極為復(fù)雜的抗原構(gòu)造，是沿海地區(qū)引起食物中毒和急性腹瀉的主要致病菌，探究副溶血弧菌臨床血清分型的分布情況，對該病的預(yù)防控制具有重要的意義。研究顯示，2013年食源性疾病監(jiān)測臨床病例副溶血弧菌分離株67 株，共分為16 種不同的血清型，其中菌株數(shù)＞5 的血清型有3 種，分別為O3:K6、O4:K68 和O4:K8，由此也說明這幾種血清型為沈陽地區(qū)副溶血弧菌比較常見的血清型。其中最主流的血清型為O3:K6，所占比例為32.84﹪，這與國內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道是一致的[3-6]。其次為O4:K68，所占比例為13.43﹪，這與報(bào)道中除O3:K6 外O4:K8為較為常見的血清型稍有不同[7-8],國外有報(bào)道認(rèn)為，O4:K68 血清型可能是由O3:K6 通過其O 抗原和K 抗原的突變遺傳進(jìn)化而來[9]。日本曾近連續(xù)12年調(diào)查食源性副溶血弧菌的血清型，發(fā)現(xiàn)每年最主流的血清型別都有很大的不同[10]。2005年沈陽地區(qū)引起食物中毒的副溶血弧菌血清型主要以O(shè)3 群和O1 群為主[11]，通過對2013年沈陽市食源性疾病監(jiān)測臨床分離株血清型的鑒定，目前沈陽市副溶血弧菌血清型主要以O(shè)3 和O4 為主，同時(shí)在分離株中發(fā)現(xiàn)3 株新血清型，4 株K 混合多價(jià)凝集但單價(jià)不能定型，說明副溶血弧菌血清型具有多樣性。該研究缺少毒力基因方面的檢測，結(jié)合血清分型共同分析，以了解分離株的毒力基因特征，以及與血清型的內(nèi)在聯(lián)系，有待今后進(jìn)一步考察。

[1]董雪,王秋雨,金莉莉,等.副溶血性弧菌分子分型和檢測研究進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(2):379-381.

[2]馬立芝,郭李平,邱業(yè)峰.副溶血弧菌的致病機(jī)制[J].生物技術(shù)通訊,2013,24（6）:871-875.

[3]何冬梅,朱海明,馬聰,等.廣東省食源性副溶血弧菌表型特征與分型比較研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2011,32(12):1259-1263.

[4]王藝,扈慶華,牟瑾,等.深圳市2007-2008年腹瀉病副溶血弧菌監(jiān)測及分子特性分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2010,3l(1):51-55.

[5]曲梅,張新,劉桂榮,等.北京市副溶血弧菌病原學(xué)和分子流行病學(xué)特征分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2011,32(12):1255-1258.

[6]李婧,王中強(qiáng),蘇文莉,等.沈陽地區(qū)副溶血弧菌脈沖場凝膠電泳分析[J].中國公共衛(wèi)生,2012,28(5):696-698.

[7]張蔚,潘勁草,孟冬梅,等.杭州地區(qū)2000-2002年副溶血弧菌的分子分型研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2006,27(4):343-346.

[8]石曉路,王藝,扈慶華,等.深圳地區(qū)2002-2008年副溶血弧菌分子特征研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2013,34(6):609-613.

[9]Okura M1,Osawa R,Tokunaga A.Genetic analyses of the putative O and K antigen gene clusters of pandemic Vibrio parahaemolyticus[J].Microbiol Immunol,2008,52(5):251-264.

[10]Obata H,Kai A,Morozumi S.The trends of Vibrio parahaemolyticus foodborne outbreaks in Tokyo:1989-2000[J].Kansenshogaku Zasshi,2001,75(6):485-489.

[11]金莉莉,董雪,王秋雨,等.副溶血性弧菌重復(fù)序列-PCR 分型研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(3):389-394.