鄒榮軍，梁祖鳳，石婉婷，朱悅誠(chéng)，李秋鳳，郭 馨，田 晶

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.臨床醫(yī)學(xué)院，2.公共衛(wèi)生學(xué)院，3.生理教研室，吉林吉林 132013)

氯化鈷誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞缺氧損傷作用的研究

鄒榮軍1，梁祖鳳2，石婉婷1，朱悅誠(chéng)1，李秋鳳1，郭 馨1，田 晶3*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.臨床醫(yī)學(xué)院，2.公共衛(wèi)生學(xué)院，3.生理教研室，吉林吉林 132013)

目的 探討氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞缺氧損傷的作用及相關(guān)機(jī)制。方法 用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)觀察不同濃度CoCl2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)情況影響;ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3及缺氧相關(guān)蛋白HIF-1α的表達(dá)情況。結(jié)果 CoCl2可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷，并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性;CoCl2作用于SH-Y5Y細(xì)胞導(dǎo)致HIF-1α、Caspace-3和Bax的表達(dá)增多(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)減少(P＜0.01)。結(jié)論 CoCl2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞缺氧損傷與上調(diào)HIF-1α表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

CoCl2;SH-SY5Y細(xì)胞;缺氧模型

Key words:CoCl2;SH-SY5Y cells;hypoxiamodel

缺血性腦血管疾病(Ischemic cerebral vascular disease，ICVD)因發(fā)病率高、致殘率高，與心臟病、惡性腫瘤一起構(gòu)成了人類的三大致死性疾病。美國(guó)流行病學(xué)研究［1］預(yù)測(cè)，到2030年發(fā)達(dá)國(guó)家65歲以上老年人當(dāng)中將會(huì)有1/5的人患此疾病。缺血性腦血管病發(fā)生時(shí)，缺血會(huì)直接引起神經(jīng)細(xì)胞的缺氧損傷，引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、結(jié)構(gòu)改變和功能減退，這與癲癇、阿爾茨海默癥、帕金森等多種疾病密切相關(guān)。氯化鈷(CoCl2)因使用方便、理化性質(zhì)穩(wěn)定成為誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧損傷首選藥物，在各類腫瘤、視網(wǎng)膜疾病、腦血管疾病等研究中都發(fā)揮了重要作用。SH-SY5Y細(xì)胞是人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，在結(jié)構(gòu)和功能上與神經(jīng)元極為相似，在實(shí)驗(yàn)研究過程中常將其作為神經(jīng)元的替代細(xì)胞，因此在研究ICVD中也有一定的代表意義［2］。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)CoCl2誘導(dǎo)SHS-Y5Y細(xì)胞化學(xué)缺氧損傷的報(bào)道少，機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞為研究對(duì)象，用不同濃度CoCl2處理不同時(shí)間段誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷，探究其分子機(jī)制，分析其在建立缺血性腦血管疾病模型的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CoCl2、MTT、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible fator 1α，HIF-1α)、Caspase-3、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bax抗體及酶標(biāo)山羊抗兔lgG抗體均購(gòu)自北京中杉公司;二甲基亞砜(DMSO)由天津市大茂化學(xué)試劑廠提供;細(xì)胞培養(yǎng)箱，北京東方安若生化科技有限公司生產(chǎn);酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞由吉林醫(yī)藥學(xué)院生化教研室李妍博士贈(zèng)送。細(xì)胞培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，每2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并拍照，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%之后進(jìn)行傳代。

1.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成密度為5×104/mL的細(xì)胞懸液，以每孔100μL接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后分組，對(duì)照組加入200μL無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含CoCl2濃度為100、200及400μmol/L的無血清培養(yǎng)基，并分別作用12、24及48 h。終止時(shí)每孔加入20μLMTT，37℃孵育4 h，棄上清后每孔加入150μL DMSO，低速震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)得吸光度值并記錄結(jié)果。

1.4 ELISA法檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)

將收集上清液與包被液按1∶1比例加入到96孔板中，對(duì)照組為100%包被液，每孔200μL/L。封閉液封閉1.5 h，PBST洗凈后加入一抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)孵育過夜，PBST洗凈后加入二抗室溫孵育1.5 h，顯色、終止，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)得吸光度值并記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CoCl2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的評(píng)價(jià)

CoCl2可以引起SH-SY5Y細(xì)胞的損傷，并具有時(shí)間和劑量依賴性。CoCl2處理時(shí)間越長(zhǎng)、濃度越高，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷越明顯(圖1)。

圖1 不同濃度的CoCl2作用不同時(shí)間后對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響

2.2 CoCl2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)

200μmol/L CoCl2作用SH-SY5Y細(xì)胞24 h后采用ELISA法測(cè)得空白組(control)與模型組(treacted group)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明:與空白組相比模型組HIF-1α、Caspace-3和Bax表達(dá)增多(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)減少(P＜0.01)(圖2)。

圖2 CoCl2處理SH-SY5Y細(xì)胞后相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)情況

3 討論

大量的研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦病的發(fā)生與大腦缺血缺氧后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基的形成、Ca2+超載、凋亡調(diào)控基因的激活、MPTP開放和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等方面變化導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)［3］，臨床上表現(xiàn)為肢體運(yùn)動(dòng)障礙、失語、記憶力減退、精神萎靡、行為異常等癥狀。缺血性腦病的治療依然依靠藥物治療，因此建立穩(wěn)定缺氧模型用作藥物研究至關(guān)重要。本研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用 CoCl2建立缺氧模型，CoCl2可以誘導(dǎo) SHSY5Y細(xì)胞的損傷、抑制增殖，并具有時(shí)間和劑量依賴性。CoCl2處理時(shí)間越長(zhǎng)、濃度越高對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷及抑制越明顯。目前研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷的機(jī)制:一方面Co2+可置換神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的氧感受器類血紅素蛋白及一些催化酶中的Fe2+，使細(xì)胞內(nèi)類血紅素不能和氧結(jié)合而保持脫氧狀態(tài)，從而模擬缺氧［4］;另一方面CoCl2作用細(xì)胞后會(huì)使HIF-1α表達(dá)增多，HIF-1α具有雙面作用，一定條件下可使神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生缺氧耐受能力，超出細(xì)胞調(diào)節(jié)能力后又可導(dǎo)致其產(chǎn)生缺氧損傷［5-7］;此外最重要的是CoCl2作用細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生氧自由基蓄積，能夠?qū)е掳麧{內(nèi)Ca2+超載、絲裂原蛋白(MAPK)異?；罨癇cl-2家族凋亡蛋白表達(dá)異常等變化，繼而導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity pore，MPTP)開放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)激活［8］。因此，采用CoCl2建立ICVD體外模型比較穩(wěn)定，效果理想且符合疾病發(fā)生的分子機(jī)制，是相對(duì)理想的造模藥物。

本研究中發(fā)現(xiàn)在用200μmol/L CoCl2作用SHSY5Y細(xì)胞24 h后HIF-1α、Caspace-3和Bax的表達(dá)增多，Bcl-2表達(dá)減少。因此，CoCl2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞缺氧損傷可能與HIF-1α表達(dá)增多，Bax/Bcl-2比值增高，繼而導(dǎo)致Caspase系統(tǒng)激活引起細(xì)胞凋亡有關(guān)。這些結(jié)果與腦缺氧損傷的變化是相符的，因此可以應(yīng)用CoCl2在SH-SY5Y細(xì)胞上建立缺氧模型用于藥物研究。體外采用氯化鈷誘導(dǎo)化學(xué)缺氧致SHSY5Y細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃?jiǎn)單、易于操作、重復(fù)性好，可較好模擬體內(nèi)缺氧/缺血狀態(tài)，對(duì)缺血性腦病治療藥物的開發(fā)具有重要意義。

［1］ Dorsey ER，George BP，Leff B，et al.The coming crisis:obtaining carefor the growing burden of neurodegenerative condition［J］.Neurology，2013，80(21):1989-1996.

［2］ Bhaskara VK，Mohanam I，GujratiM，et al.Intermittent hypoxia effecton osteoclastogenesis stimulated by neuroblastoma cells［J］.PLoSOne，2014，9(8):e105555.

［3］ 馮金洲.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠線粒體途徑凋亡模式及姜黃素保護(hù)作用探討［D］.重慶:重慶醫(yī)科大學(xué)，2013.

［4］ Ohtomo S，Nangaku M，Izuhara Y，et al.Cobalt ameliorates renal injury in an obese，hypertensive type 2 diabetes rat model［J］.Nephrol Dial Transplant，2008，23(4):1166-1172.

［5］ Hashmi S，Al-Salam S.Hypoxia-inducible factor-1Alpha in the heart:a double agent?［J］.Cardiol Rev，2012，20(6): 268-273.

［6］ Jeong JK，Moon MH，Park YG，et al.Gingerol-induced hypoxia-inducible factor 1 alpha inhibits human prion peptide-mediated neurotoxicity［J］.Phytother Res，2013，27 (8):1185-1192.

［7］ Gilkes DM，Semenza GL，Wirtz D.Hypoxia and the extracellularmatrix:drivers of tumour metastasis［J］.Nat Rev Cancer，2014，14(6):430-439.

［8］ Brookes PS，Yoon Y，Robotham JL，et al.Calcium，ATP and ROS:amitochondrial love-hate triangle［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287(4):C817-833.

Cobalt chloride induced hypoxia on SH-SY5Y cells

ZOU Rongjun1，LIANG Zufeng2，SHIWanting1，ZHU Yuecheng1，LIQiufeng1，GUO Xin1，TIAN Jing3*
(1.Clinical Medical College，2.School of Public Health，3.Department of Physiology，Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Province，132013，China)

Objective To investigate the hypoxia injury and mechanism of Cobalt chloride(CoCl2)on SH-SY5Y cells.Methods Different doses of CoCl2were used to treat SH-SY5Y cells，MTT assay was employed to examine the growth of the cells.ELISA was used to detect the expressions of Bax，Bcl-2，Caspase-3 and HIF-1α.Results The inhibitory effect of CoCl2was appeared in a time and dosage dependentmanner.CoCl2could increase the expression of Caspase-3，Bax and HIF-1α(P＜0.05)，while reduce the expression of Bcl-2(P＜0.01).Conclusion CoCl2could induce hypoxia on SH-SY5Y cells by up-regulating HIF-1αand inducing apoptosis.

R743.3

A

1673-2995(2015)01-0012-03

2014-11-11)

吉林省教育廳項(xiàng)目(2014369);吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(2013845).

鄒榮軍(1991－)，男(漢族)，本科在讀.

田 晶(1973－)，女(漢族)，副教授，碩士.