郗艷麗，吳啟坤，馮 威，張洋婷，宋春梅，馬洪波，王舒然

(吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林132013)

·論 著·

齊墩果酸對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

郗艷麗，吳啟坤，馮 威，張洋婷，宋春梅，馬洪波，王舒然*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林132013)

目的 研究齊墩果酸對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷保護(hù)作用。方法 30只雄性昆明小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組和齊墩果酸組。齊墩果酸組以300 mg/kg齊墩果酸豆油溶液灌胃，模型組和正常對(duì)照組以相同劑量的豆油灌胃，共2 d。末次灌胃給藥后，模型組和齊墩果酸組按3 mL/kg劑量皮下注射CCl4原液，正常對(duì)照組皮下注射同等體積的生理鹽水。24 h后處死小鼠，摘取肝臟，比較各組小鼠肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量，并觀察肝臟組織的臟器系數(shù)及病理學(xué)改變。結(jié)果 齊墩果酸能顯著升高CCl4引起的SOD降低(P＜0.05)，降低CCl4導(dǎo)致的MDA的升高(P＜0.05)。與模型組相比，齊墩果酸組肝臟的臟器系數(shù)有下降的趨勢(shì)，同時(shí)減輕了肝臟的病理?yè)p害。結(jié)論 齊墩果酸對(duì)CCl4所引起的急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

齊墩果酸;急性肝損傷;保護(hù)作用

齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)又名土當(dāng)歸酸，是一類廣泛存在于多種植物中的五環(huán)三萜類化合物，目前被證實(shí)其具有降糖、降脂、抗菌、抗病毒、抗腫瘤及保肝護(hù)肝等多種藥理作用［1-2］。本實(shí)驗(yàn)研究齊墩果酸對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

齊墩果酸購(gòu)于西安文竹生物科技有限公司(HPLC≥98%)，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。722型分光光度計(jì):中國(guó)廈門分析儀器廠;離心機(jī)(TDZ5-WS):湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;電子天平(BS224S):北京賽多利斯;電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(DY89-Ⅱ):寧波新芝生物科技股份有限公司。尼康科研級(jí)正置熒光顯微成像系統(tǒng);Leica半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2245);Leica組織包埋機(jī)(EG1150H+C)。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方法

30只健康雄性昆明小鼠，普通級(jí)，體重(27±2) g，購(gòu)于吉林大學(xué)動(dòng)物室。全部動(dòng)物隨機(jī)分成3組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、模型組和齊墩果酸組。齊墩果酸組給予齊墩果酸豆油溶液(300 mg/kg)灌胃。正常對(duì)照組和模型組以等體積豆油灌胃，1次/ d，連續(xù)2 d，末次給藥后30 min，模型組和齊墩果酸組均皮下注射CCl4原液(3 mL/kg)，禁食，不禁水。正常對(duì)照組皮下注射同等劑量的生理鹽水。24 h后處死小鼠。取肝臟備檢。

1.3 肝臟臟器系數(shù)的測(cè)定

稱量每只小鼠活體重，處死后稱量肝臟濕重。肝臟臟器系數(shù) =肝臟濕重(g)/小鼠活體重(g)× 100%。

1.4 病理組織學(xué)檢測(cè)

切取肝臟右葉置于10%福爾馬林溶液中固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色并鏡檢。

1.5 超氧化物歧化酶檢測(cè)

切取肝臟左葉0.5 g，加入4.5 mL生理鹽水，置于電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)制備成10%的肝臟組織勻漿。1 500 rpm持續(xù) 1 min，研杵上下移動(dòng) 15次。3 000 rpm離心10 min，取上清，鄰苯三酚法檢測(cè)肝組織勻漿中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)含量。

1.6 丙二醛檢測(cè)

切取肝臟左葉0.5 g，加入4.5 mL 150 mmol/L KCl溶液，置于電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)制備成10%的肝臟組織勻漿。1 500 rpm持續(xù)1 min，研杵上下移動(dòng)15次。3 000 rpm離心10 min，取上清，硫代巴比妥酸法檢測(cè)肝組織勻漿中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸對(duì)小鼠肝臟臟器系數(shù)的影響

由表1可知，模型組與正常對(duì)照組的肝臟臟器系數(shù)經(jīng)方差分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組肝臟的臟器系數(shù)高于正常對(duì)照組，說(shuō)明利用CCl4所制備的急性肝損傷模型造模成功。利用齊墩果酸提前干預(yù)的齊墩果酸組的肝臟臟器系數(shù)與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與模型組比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但是齊墩果酸組的肝臟臟器系數(shù)明顯地低于模型組，而與正常對(duì)照組比較，略有增高。這一結(jié)果表明，齊墩果酸對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

表1 齊墩果酸對(duì)小鼠肝臟臟器系數(shù)的影響

2.2 肝臟的病理改變

光鏡下可見(jiàn)正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹、病變以及壞死。模型組肝臟細(xì)胞可見(jiàn)明顯的腫脹，體積增大，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。齊墩果酸組部分肝臟細(xì)胞可見(jiàn)腫脹，與模型組比較，細(xì)胞體積雖有增大，但不明顯，正常肝細(xì)胞數(shù)目較多。

2.3 齊墩果酸對(duì)小鼠肝臟SOD含量的影響

模型組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組SOD活性與對(duì)照組相比明顯降低。齊墩果酸組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。齊墩果酸組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，齊墩果酸組SOD活性與模型組相比明顯升高。SOD活性檢測(cè)結(jié)果表明，齊墩果酸可以改善由CCl4所引起的SOD活性降低，提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力(圖1)。

2.4 齊墩果酸對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響

模型組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組肝臟MDA含量與對(duì)照組相比明顯升高。齊墩果酸組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。齊墩果酸組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，齊墩果酸組肝臟MDA含量與模型組相比明顯降低。MDA含量檢測(cè)結(jié)果表明，齊墩果酸可以改善由CCl4所引起的MDA水平降低，抑制由CCl4導(dǎo)致的氧化損傷(圖2)。

圖1 齊墩果酸對(duì)小鼠肝臟SOD含量的影響

圖2 齊墩果酸對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響

3 討論

肝損傷模型的造模方法有很多種，其中由CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是最常見(jiàn)的肝損傷模型之一。造模原理是由于CCl4易溶解脂肪，是一種非常典型的肝臟毒物。CCl4進(jìn)入體內(nèi)后，會(huì)引起細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，其中由磷脂雙分子層組成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損嚴(yán)重，引起細(xì)胞膜的通透性增高，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，甚至是壞死，出現(xiàn)急性肝損傷的癥狀［5-6］。本實(shí)驗(yàn)所制備的急性肝損傷模型組，其肝臟的臟器系數(shù)明顯高于正常對(duì)照組，且組織切片檢測(cè)結(jié)果表明肝臟細(xì)胞出現(xiàn)了腫脹，這表明由于CCl4的作用導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)了炎性浸潤(rùn)的癥狀，細(xì)胞膜的通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致了肝臟的臟器系數(shù)增高，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致［7］。

SOD是生物體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)，能夠?qū)棺杂苫鶎?duì)細(xì)胞造成的氧化損傷，并能夠使受損的細(xì)胞修復(fù)，可作為急性肝損傷的檢測(cè)指標(biāo)之一。當(dāng)機(jī)體受到自由基損傷以后，SOD的生物活性會(huì)受到影響，導(dǎo)致活性降低。CCl4作用于機(jī)體后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)自由基含量升高，SOD活性降低。實(shí)驗(yàn)小鼠提前給予齊墩果酸作用后，當(dāng)接觸CCl4后對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用，SOD的活性受CCl4的影響不大。

MDA是生物體脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其具有細(xì)胞毒性作用。因此，MDA的大量產(chǎn)生表明體內(nèi)受大量自由基作用。CCl4作用實(shí)驗(yàn)小鼠以后，模型組MDA的含量明顯高于正常對(duì)照組，表明CCl4已經(jīng)造成了急性肝損傷，模型制備成功。齊墩果酸組MDA的含量與對(duì)照組相比明顯下降，表明齊墩果酸對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷有保護(hù)作用。齊墩果酸可能是通過(guò)清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，起到保護(hù)肝臟的作用。提前服用齊墩果酸，可以避免肝臟的急性損傷，尤其是氧化應(yīng)激引起的急性損傷。齊墩果酸在保肝、護(hù)肝方面具有很大的開發(fā)前景。

［1］ 張小麗，韋晟.齊墩果酸對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞糖原代謝的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2013，29(4):293-295.

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［3］ 熊筱娟，陳武，肖小華，等.烏索酸與齊墩果酸對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷保護(hù)作用的比較［J］.江西師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，28(6):540-543.

［4］ 羅奕，劉文.齊墩果酸對(duì)四氯化碳所致大鼠肝纖維損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥師，2014，17(3):378-381.

［5］ 林冬靜，金政.決明子提取物對(duì)急性肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(2):214-215.

［6］ 陳紅霞，吳咖，黃仁彬，等.相思藤總黃酮對(duì)小鼠急性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2012，34 (2):138-141.

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The protective effects of oleanolic acid against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in m ice

XIYanli，WU Qikun，F(xiàn)ENGWei，ZHANG Yangting，SONG Chunmei，MA Hongbo，WANG Shuran*
(School of Public Health，Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Province，132013，China)

Objective To study the protective effects of oleanolic acid against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in micee.Methods Thirtymalemice were randomly divided into normal group，model group and oleanolic acid group.Oleanolic acid group was pretreated with oleanolic acid and soybean oilmixture solution by intragastric administration at the dosage of 300 mg/kg for 2 days;model and normal groupswere pretreated with the same volume of soybean oil.On the last day of intragastric administration，model and oleanolic acid groupswere subcutaneous injected with 3 mL/kg carbon tetrachloride，and normal group was subcutaneous injected with the same volume of physiological saline.Twenty-four hours after subcutaneous injection，themice were sacrificed and liverswere removed.The contents of SOD and MDA from liver homogenate serum were determined，and the organ coefficient and pathological changes of liver were alsomeasured.Results Oleanolic acid significantly increased the low level of SOD and decreased the high level of MDA-induced by carbon tetrachloride.Compared with themodel group，the organ coefficient and pathological damage of liver in oleanolic acid group was slightly decreased.Conclusion Oleanolic acid has protective effects against acute liver injuryinduced by carbon tetrachloride.

oleanolic acid;acute liver injury;protective effects

R285.5

A

1673-2995(2015)01-0001-03

2014-08-04)

郗艷麗(1981－)，女(漢族)，講師，博士.

王舒然(1968－)，男(漢族)，教授，博士.