呂莉，王繼紅，邵鈁鈺，鄭媛媛，王躍，李玲欣，肖蓉，李慶偉*

(1.遼寧師范大學海洋生物功能基因與蛋白質(zhì)組學研究所，遼寧大連116029;2.大連醫(yī)科大學藥理教研室，遼寧大連116044)

重組日本七鰓鰻毒素蛋白rLj-RGD3及其4種突變體抗血小板聚集活性的比較

呂莉1，2，王繼紅1，邵鈁鈺2，鄭媛媛1，王躍2，李玲欣1，肖蓉1，李慶偉1*

(1.遼寧師范大學海洋生物功能基因與蛋白質(zhì)組學研究所，遼寧大連116029;2.大連醫(yī)科大學藥理教研室，遼寧大連116044)

目的初步探討rLj-RGD3分子中3個RGD模體對野生型rLj-RGD3抗血小板聚集活性的作用。方法全序列人工合成并重組表達、純化4種rLj-RGD3缺失突變體蛋白。制備富血小板血漿(PRP)，與不同濃度各重組突變體蛋白共溫浴，采用Born氏比濁法測定ADP誘導的血小板聚集率，并計算血小板聚集抑制百分率，以評價野生型rLj-RGD3及其4種突變體蛋白的抗血小板聚集活性。結(jié)果成功重組表達純化4種可溶性rLj-RGD3缺失突變體蛋白，rLj-RGD3抗血小板聚集活性最高，rLj-RGD3-0不具有抗血小板聚集功能，rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2及rLj-RGD3-3活性相當。結(jié)論3個RGD模體在rLj-RGD3抗血小板聚集功能中均十分重要，并不分伯仲，而rLj-RGD3因分子中含有3個RGD模體而活性最強。

七鰓鰻;rLj-RGD3;突變體;血小板;血小板聚集

RGD 毒素肽是某些有毒生物唾液腺分泌物中特有的以RGD(Arg-Gly-Asp)為特征性模體的生物活性肽，具有抗腫瘤、抗血小板聚集等功能［1］。重組日本七鰓鰻RGD毒素肽rLj-RGD3為源自于海洋洄游魚類日本七鰓鰻口腔腺的可溶性蛋白，由118個氨基酸組成，理論分子量為1.36×104，其一級結(jié)構(gòu)中含有3個RGD模體。本研究組先期研究發(fā)現(xiàn)rLj-RGD3憑借其分子中含有的3個RGD模體而具有抗血小板聚集功能［2］。為探明其3個RGD模體的作用方式，本研究對野生型rLj-RGD3進行RGD模體的缺失突變，并對rLj-RGD3及其突變體蛋白的抗血小板聚集活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

pET23b質(zhì)粒、BL21菌，由遼寧師范大學海洋生物功能基因與蛋白質(zhì)組學研究所實驗室提供;4種rLj-RGD3突變體合成基因，由大連寶生物工程有限公司提供;組氨酸親和層析柱(His·Bind Column)，德國Novagen公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒、IPTG、NdeⅠ及HindⅢ均購自大連寶生物工程有限公司;枸櫞酸鈉，浙江杭州蕭山化學試劑廠產(chǎn)品;ADP，購自上海solarbio生物科技公司;LBY-NJ2血液凝聚儀，北京普利生儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 野生型rLj-RGD3及其四種突變體蛋白的基因

合成、蛋白質(zhì)誘導表達、純化

按文獻［3-5］方法，對4種rLj-RGD3缺失突變體rLj-RGD3-0、rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2、rLj-RGD3-3進行基因全序列人工合成，以NdeⅠ與HindⅢ為酶切位點構(gòu)建pET23b載體獲得基因重組質(zhì)粒，以CaCl2法將獲得的陽性基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達菌BL21大腸桿菌中，用IPTG誘導表達重組蛋白，以組氨酸親和層析柱(His·Bind Column)進行純化蛋白，并采用Tricine SDS-PAGE小分子量蛋白質(zhì)電泳法鑒定各重組蛋白。

1.3 野生型rLj-RGD3及其4種突變體蛋白抗血小

板聚集活性的比較

采集健康志愿者靜脈血，以3.8%枸櫞酸鈉(按血與抗凝劑體積比9∶1)抗凝，1 000 rpm離心5 min取上清即得富血小板血漿(PRP)，余血經(jīng)3 000 rpm離心10 min，獲得貧血小板血漿(PPP)，以PPP調(diào)PRP使血小板數(shù)至3×108/L，將不同濃度的各重組蛋白與PRP預溫(空白對照加入等容量生理鹽水)，以ADP(終濃度3μmol/L)為誘導劑，按Born氏比濁法［6］分別于血液凝聚儀中測定血小板5 min最大聚集率，并計算血小板聚集抑制百分率。血小板聚集抑制百分率(%)=［(對照組血小板聚集%－給藥組血小板聚集%)/對照組血小板聚集%］×100%。

2 結(jié)果

2.1 野生型rLj-RGD3及其4種突變體蛋白的基因合成、蛋白質(zhì)誘導表達、純化

人工合成的4種缺失突變體 rLj-RGD3-0、rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2、rLj-RGD3-3基因序列經(jīng)測序證實其序列均完全正確。野生型rLj-RGD3及其4種缺失突變體的cDNA序列及其推導的氨基酸序列如圖1所示。

采用人工合成基因序列并通過分子克隆方法成功獲得了4種rLj-RGD3缺失突變體的基因重組蛋白的可溶性表達。其經(jīng)組氨酸親和層析純化后小分子量蛋白質(zhì)電泳鑒定結(jié)果如圖2所示。將制備的各重組蛋白定量后進行抗血小板活性的比較。

圖1 野生型rLj-RGD3及4種突變體的cDNA序列及其推導的氨基酸序列

圖2 親和層析純化蛋白的Tricine SDS-PAGE電泳圖

2.2 野生型rLj-RGD3及其4種突變體蛋白抗血小

板聚集活性的比較

如圖3所示，野生型rLj-RGD3較缺失突變的4種突變體的抗血小板聚集活性均高，其僅含一個RGD模體的3種突變體活性相當，而將RGD模體全部缺失的rLj-RGD3-0不具有抗血小板聚集活性。提示，3個RGD模體在抗血小板功能中均十分重要，并不分伯仲，而rLj-RGD3因分子中含有3個RGD模體而活性最強。

圖3 rLj-RGD3及4種突變體對ADP誘導的人血小板聚集活性的影響

3 討論

RGD毒素肽因其分子中的RGD模體能專一性地與血小板纖維蛋白原受體——糖蛋白GPⅡb/Ⅲa結(jié)合，競爭性地拮抗纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，防止血小板的活化和GPⅡb/Ⅲa受體構(gòu)象的改變，從而抑制血小板聚集的最終共同通路，產(chǎn)生抗血栓形成作用［7］。本研究中受試的野生型Lj-RGD3分子中含有3個RGD模體，前期實驗結(jié)果已證實其具有抗血小板凝集的生物學活性［2］。為了研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，本研究對其基因進行了缺失突變，并重組表達了4種可溶性重組蛋白rLj-RGD3-0、rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2和rLj-RGD3-3。由于野生型rLj-RGD3基因含大量重復序列，定點突變困難，因而本實驗對缺失突變體進行了全序列合成，其中rLj-RGD3-0為缺失掉全部RGD模體，rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2和rLj-RGD3-3分別保留第一位、第二位和第三位RGD模體，它們的分子量均為1.5×104。

抗血小板活性的比較結(jié)果顯示，分子中不含有RGD模體的缺失突變體rLj-RGD3-0不具有抗血小板聚集活性，僅含一個RGD模體的另3種突變體活性相當，而含有3個RGD模體的野生型rLj-RGD3抗血小板聚集活性最高?？梢?，RGD模體是RGD毒素蛋白rLj-RGD3具有抗血小板聚集活性的結(jié)構(gòu)基礎，但三個位置上的RGD對其產(chǎn)生活性的貢獻并不分伯仲，而rLj-RGD3正是因其分子中含有3個RGD模體而具強大的抗血小板聚集作用。

［1］Careya CM，Bueno R，Gutierrez DA，et al.Recombinant rubistatin(r-Rub)，an MVD disintegrin，inhibits cell migration and proliferation，and is a strong apoptotic inducer of the humanmelanoma cell line SK-Mel-28［J］.Toxicon，2012，59(2):241-248.

［2］Wang Jihong，Han Xiaoxi，Yang H，et al.A novel RGD-toxin protein，Lj-RGD3，from the buccal gland secretion of Lampetra japonica impacts diverse biological activities［J］.Biochimie，2010，92(10):1387-1396.

［3］ 張亞前，李慶偉，呂莉，等.日本七鰓鰻Lj-RGD3缺失突變體Lj-113人工合成序列的基因克隆與蛋白表達［J］.吉林醫(yī)藥學院學報，2011，32(2):73-76.

［4］Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.分子克隆實驗指南［M］.金冬雁，黎需楓，譯.2版.北京:科學出版社，1992:55-56，304-313.

［5］Schgger H，von Jagow G.Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa［J］.Anal Biochem，1987，166(2):368-379.

［6］Born Gustav VR.Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal［J］.Nature，1962，194 (4832):927-929.

［7］Sánchez EE，Galán JA，Russell WK，et al.Isolation and characterization of two disintegrins inhibiting ADP-induced human platelet aggregation from the venom of Crotalus scutulatus scutulatus(Mohave Rattlesnake)［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2006，212(1):59-68.

The com parison of rLj-RGD3，a kind of recombinant toxin protein from Lampetra japonica，and its 4 mutants on anti-p latelet aggregation activities

LLi1，2，WANG Jihong1，SHAO Fangyu2，ZHENG Yuanyuan1，WANG Yue2，LILingxin1，XIAO Rong1，LIQingwei1*
(1.Department of Biological Sciences，Liaoning Normal University，Dalian，Liaoning Province，116029;2.Department of Pharmacology，Dalian Medical University，Dalian，Liaoning Province，116044，China)

ObjectiveTo investigate the effects of the three RGD motifs ofwild rLj-RGD3 on its anti-platelet aggregation activity.MethodsGene sequences of4 deletionmutantswere synthesized and the 4 kinds of recombinant deletion mutant proteinswere expressed and purified.Platelet-rich plasma(PRP)was prepared.Different concentrations of the recombinantmutant proteinswere added into PRP，separately.ADP-induced platelet aggregation rates were determined by using Born's turbidimetrymethod.Then the inhibition rates of platelet aggregation were calculate to evaluate the anti-platelet activities of rLj-RGD3 and itsmutants.ResultsThe four kinds of purified recombinant soluble rLj-RGD3 deletionmutant proteinswere obtained successfully.rLj-RGD3 exhibited the highestanti-plateletaggregation activity，rLj-RGD3-0 did nothave anti-platelet aggregation effect，rLj-RGD3-1，rLj-RGD3-2 and rLj-RGD3-3 exhibited middle anti-platelet aggregation activity equally.ConclusionEach RGD motif plays a very important role in rLj-RGD3 on its anti-platelet aggregation function at the same level，and wild rLj-RGD3 has a strong anti-platelet aggregation activity because of its three RGD motifs.

Lampetra japonica;rLj-RGD3;mutant;platelet;platelet aggregation

Q78

A

1673-2995(2015)03-0164-03

2015-01-14)

國家自然科學基金(81202455);國家高技術(shù)研究發(fā)展863計劃資助項目(SS2014AA091602);國家海洋公益項目(201305016-5).

呂莉(1972－)，女(漢族)，副教授，在讀博士.

李慶偉(1955－)，男(漢族)，教授，博士.