陳美惠，石鶴坤，侯中華，陳開(kāi)杰，林小鳳，王曙東，陳錦珊

復(fù)方風(fēng)柜斗草由中藥風(fēng)柜斗草和向天盞組成［1］，風(fēng)柜斗草(Sarcopyramis nepalensis Wall)又名肉穗草、風(fēng)鼓斗草，來(lái)源于野牡丹科植物肉穗草屬楮頭紅的全草，其性平、味甘，具有涼熱解毒、涼血利水、去肝火、清肺熱的功效，用于急性肝炎、肺熱咳嗽、風(fēng)濕痹痛、耳鳴耳聾及目霧羞明等治療。廖梅等［2］報(bào)道風(fēng)柜斗草的正丁醇提取部分具有抑制四氯化碳(CCl4)所致肝損傷所引起的轉(zhuǎn)氨酶升高的作用。向天盞(Scutellaria indica L.)又名韓信草、大力草、耳挖草(《生草藥性備要》)、金茶匙(《本草求原》)、順經(jīng)草(貴州)、大葉半枝蓮(廣西)、虎咬癀(福建)，為唇形科植物向天盞的全草，主要分布于江南各省區(qū)，其味辛、微苦、性涼，歸肺、肝經(jīng)，有清熱解毒、利水消腫、止痛的功效［3］。本實(shí)驗(yàn)采用以上兩藥合用，探討其保護(hù)小鼠急性肝損傷的作用，為進(jìn)一步研究該藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 復(fù)方風(fēng)柜斗草醇提取物，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科提供(批號(hào):20140620)，聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江萬(wàn)邦藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):A02130212)。

1.2 試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒、總膽紅素(T-BIL)測(cè)定試劑盒、直接膽紅素(D-BIL)測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。CCl4購(gòu)于天津市福晨化學(xué)試劑有限公司，羧甲基纖維素鈉(CMCNa)購(gòu)于西隴化工股份有限公司，冰乙酸為天津市福晨化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，無(wú)水乙醇為廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn)，以上試劑均為分析純。大豆油購(gòu)于中糧東州糧食工業(yè)(廣州)有限公司。

1.3 儀器 ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)西門(mén)子公司)、UV-2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、Pico-17高速離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾公司)、BS223S電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán)公司)、Model 680酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)有限公司)、MS3 digital震搖器(德國(guó)IKA工業(yè)公司)、420-A型恒溫水浴箱(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)ICR種小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供［許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境及設(shè)施符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)范》(GB14925-95)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行［許可證號(hào):SYXK(軍)2012-0054］，符合倫理準(zhǔn)則，獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由攝食飲水。

2 方法

2.1 分組與給藥 ICR種小鼠60只，隨機(jī)分為空白組、CCl4模型組、復(fù)方風(fēng)柜斗草低劑量組、中劑量組、高劑量組、聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。復(fù)方風(fēng)柜斗草給藥的高劑量為8.8 g/kg生藥，中劑量4.4 g/kg生藥、低劑量2.2 g/kg生藥;陽(yáng)性對(duì)照組給藥劑量為0.2 g/kg，灌胃給藥體積0.4 mL/10 g，1次/d，連續(xù)給藥10 d;空白對(duì)照組和模型組給予1%羧甲基纖維素鈉CMC-Na水溶液。

2.2 造模與取材測(cè)定 末次給藥后0.5 h，除空白對(duì)照組腹腔注射等量大豆油外，其余各組小鼠腹腔注射0.1%CCl4大豆油溶液(0.1 mL/10 g體重)，制備CCl4急性肝損傷模型。24 h后，各組小鼠稱體重，摘眼球取血，靜置1 h，離心半徑15 cm，3500 r/min離心10 min后分離血清，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)T-BIL、D-BIL、ALT及AST活性。小鼠處死后，立即取肝臟于預(yù)冷等滲鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱定質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)［4］，并稱取0.8～1 g，加入9倍量預(yù)冷等滲鹽水制成10%肝組織勻漿，勻漿液以4000 r/min(離心半徑15 cm)離心10 min，取上清液，測(cè)定SOD活性和MDA的含量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，T-BIL、D-BIL、ALT、AST、MDA、SOD 等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)CCl4所致肝損傷小鼠血清T-BIL、D-BIL、ALT和AST的影響 與空白組比較，模型組血清 T-BIL顯著增加(P＜0.05)，D-BIL、ALT、AST亦顯著增加(P＜0.01)，說(shuō)明急性肝損傷模型造模成功。與CCl4模型組比較，復(fù)方風(fēng)柜斗草中、高劑量組、聯(lián)苯雙酯組小鼠血清 T-BIL、D-BIL、ALT、AST明顯降低(P＜0.05或0.01)。見(jiàn)表1。

3.2 復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)CCl4所致肝損傷小鼠肝組織中MDA含量及SOD活性的影響 CCl4模型組與空白組比較，肝組織中MDA含量升高(P＜0.01)，SOD活性降低(P＜0.05)。與CCl4模型組比較，復(fù)方風(fēng)柜斗草中、高劑量組、聯(lián)苯雙酯組可降低肝損傷小鼠肝組織中MDA含量，提高SOD活性(P＜0.05或0.01)。見(jiàn)表2。

表1 復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)小鼠急性肝損傷肝血清T-BIL、D-BIL、ALT和AST的影響(±s)

表1 復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)小鼠急性肝損傷肝血清T-BIL、D-BIL、ALT和AST的影響(±s)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n 劑量(g/kg) T-BIL(μmol/L)D-BIL(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)空白組 10 － 1.16±0.28 0.55±0.14 34.75±3.56 94.73±19.17 CCl4模型組 10 － 1.67 ±0.58* 0.81±0.21＊＊ 88.72±39.25＊＊ 166.49 ±49.37＊＊低劑量組 10 2.2 1.34 ±0.36* 0.67 ±0.15＊＊ 60.83 ±32.76* 137.14 ±35.39*中劑量組 10 4.4 1.21 ±0.21* 0.57 ±0.12＊＊ 53.22 ±20.61* 125.10 ±30.75*高劑量組 10 8.8 1.21 ±0.32* 0.53 ±0.18＊＊ 46.98 ±15.27* 121.14 ±27.18*聯(lián)苯雙酯組 10 0.2 0.91 ±0.12＊＊ 0.48 ±0.13＊＊ 44.38 ±25.50＊＊ 123.97 ±30.40*

表2 復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)小鼠急性肝損傷肝組織中MDA水平及SOD活性影響(±s)

表2 復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)小鼠急性肝損傷肝組織中MDA水平及SOD活性影響(±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與 CCl4模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 n 劑量(g/kg)MDA(nmol/mL)SOD(U/mg)空白組10 － 51.82 ±16.15 159.79 ±76.99 CCl4模型組 10 － 85.38±22.94 ＊＊ 92.08±54.02*低劑量組 10 2.2 68.53 ±13.62▲ 148.17 ±58.62▲中劑量組 10 4.4 60.56 ±12.04▲▲ 150.06 ±67.49▲高劑量組 10 8.8 56.92 ±10.13▲▲ 177.98 ±53.46▲▲聯(lián)苯雙酯組 10 0.2 68.32±17.49▲ 175.71±84.79▲

3.3 復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響在10 d的給藥期間內(nèi)，高劑量組小鼠的體重增加最多，均值達(dá)到28.93 g，其次為聯(lián)苯雙酯組，見(jiàn)表3。復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)CCl4所致肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響，各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);但與空白組比較，各組小鼠的肝臟均有不同程度的腫脹，各給藥組均不能降低CCl4所致急性肝腫脹。

表3 復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

4 討論

肝臟氧化損傷可引發(fā)多種疾病或加重機(jī)體的病變。CCl4是一種經(jīng)典的誘發(fā)急性肝損傷的肝毒性藥物，選用0.1%CCl4大豆油作為造模材料，可以得到肝損傷程度合理、統(tǒng)計(jì)結(jié)果誤差較小的CCl4小鼠急性肝損傷模型［5-7］。本實(shí)驗(yàn)采用0.1%CCl4大豆油(0.1 mL/10 g體重)灌胃，與空白對(duì)照組比較，模型組血清T-BIL、D-BIL、ALT、AST水平均顯著增加，說(shuō)明急性肝損傷造模成功。

CCl4進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450作用下代謝為CCl3，并攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子，引起膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)以及直接的膜溶解作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死或肝細(xì)胞通透性增強(qiáng)，進(jìn)而引起血清中的 ALT、AST、T-BID、D-BID 含量上升［8-9］。SOD是體內(nèi)清除自由基、抑制自由基反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其活性降低則會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基積累，引發(fā)質(zhì)膜的過(guò)氧化作用，使膜結(jié)構(gòu)破壞與功能受到損傷。MDA是氧自由基攻擊生物膜結(jié)構(gòu)中的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)生成的，是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物［10-11］。小鼠腹腔注射CCl4導(dǎo)致急性肝損傷時(shí)，過(guò)量的氧自由基產(chǎn)生于肝組織細(xì)胞可引起SOD水平下降及MDA含量升高，通過(guò)檢測(cè)小鼠肝勻漿中的SOD活性及MDA含量可間接反映出藥物對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用［12-13］。

本實(shí)驗(yàn)顯示，復(fù)方風(fēng)柜斗草醇提物的高、中劑量組與聯(lián)苯雙酯對(duì)照組可顯著降低CCl4引起急性肝損害小鼠血清中的ALT、AST、T-BIL、D-BIL的含量，并提高肝勻漿組織中的 SOD活性，降低組織中MDA含量，且復(fù)方風(fēng)柜斗草高劑量組各項(xiàng)指標(biāo)與聯(lián)苯雙酯對(duì)照組接近。在小鼠體重方面，高劑量組體重均數(shù)比空白組增加2.53 g，其次為聯(lián)苯雙酯組增加1.91 g，說(shuō)明復(fù)方風(fēng)柜斗草對(duì)提高小鼠體質(zhì)量具有一定的作用。與模型組比較，各給藥組小鼠在肝臟指數(shù)方面并未見(jiàn)降低，說(shuō)明各給藥組小鼠不能降低由于CCl4引起的肝臟腫脹，其原因可能是CCl4引起損傷的早期，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞不同程度腫脹未能及時(shí)修復(fù)而導(dǎo)致肝臟指數(shù)的增加。

綜上所述，復(fù)方風(fēng)柜斗草具有保肝和對(duì)抗CCl4引起急性肝損傷的作用，其機(jī)制可能與復(fù)方風(fēng)柜斗草所具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化和清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基的作用有關(guān)，本研究為臨床應(yīng)用復(fù)方風(fēng)柜斗草治療急性肝損傷提供了理論參考。

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