張心悅，武海萍，朱逍遙，侯晶晶，卜 瑩

復(fù)方維A酸膜、復(fù)方硫酸慶大霉素膜和甲硝唑膜是《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》(2002)版［1］收載的醫(yī)院常用外用口腔制劑。其中，復(fù)方維A酸膜無(wú)抑菌性，有促進(jìn)表皮細(xì)胞增生分化作用，用于口腔白斑及扁平苔蘚等治療［2］;復(fù)方硫酸慶大霉素膜有抑菌性，能夠消炎、止痛，促進(jìn)黏膜創(chuàng)面，多用于口腔潰瘍治療;甲硝唑膜是抗厭氧菌藥膜，用于治療厭氧菌感染引起的牙周炎等口腔炎癥［3］。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)查新，目前尚未見(jiàn)這3種制劑微生物限度檢查方法的報(bào)道，為有效控制醫(yī)院制劑質(zhì)量，本文按《中國(guó)藥典》2010年版二部［4］規(guī)定進(jìn)行微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證，并建立了這3種醫(yī)院外用口腔膜劑的微生物限度檢查方法。

1 試藥與儀器

1.1 供試品 復(fù)方維A酸膜(第四軍醫(yī)大學(xué)提供，批號(hào):130801、130811、130820);復(fù)方硫酸慶大霉素膜(第四軍醫(yī)大學(xué)提供，批號(hào):130814、130819、130803);甲硝唑膜(第四軍醫(yī)大學(xué)提供，批號(hào):20131016、20130824、20131102)。

1.2 儀器設(shè)備 JY10001電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);HP型電熱恒溫培養(yǎng)箱(沈陽(yáng)利港凈化設(shè)備有限公司);SP-150A生化培養(yǎng)箱(南京恒裕儀器設(shè)備制造有限公司);SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);SX-500高壓蒸汽滅菌器(日本Tomy Digital Biology公司);HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司);HTY-300微生物過(guò)濾支架、一次性無(wú)菌過(guò)濾器(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)等。

1.3 驗(yàn)證菌株 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］;白色念珠菌［CMCC(F)98001］;枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］;黑曲霉菌［CMCC(F)98003］;大腸埃希菌［CMCC(B)44102］;銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，傳代次數(shù)均不超過(guò)5代。

1.4 培養(yǎng)基和稀釋劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):121226);玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):130105);改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):121123);改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào):130118);營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào):121213);膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號(hào):130106);甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):121030);溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):1109282);pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào):130426)，均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)。

2 驗(yàn)證方法

2.1 菌液制備 取35℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，稀釋制成含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液。取25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，稀釋制成含酵母菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液。取25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉真菌斜面培養(yǎng)物，用5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，并稀釋制成為50～100 cfu/mL的孢子液。

2.2 供試液制備 取供試品各100 cm2，加45℃pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，浸泡、振搖，使充分分散均勻，作為1∶10供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證［5］

2.3.1 試驗(yàn)組 常規(guī)法:復(fù)方維A酸膜，無(wú)抑菌性可采用常規(guī)法。取1 mL 1∶10供試液和1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌液注入一個(gè)平皿中，培養(yǎng)基澆碟、培養(yǎng)。每個(gè)試驗(yàn)菌株制備2個(gè)平皿，培養(yǎng)完畢后計(jì)菌落數(shù)，取平均值。薄膜過(guò)濾法:復(fù)方硫酸慶大霉素膜［6］，取 10 mL 1∶10 供試液薄膜過(guò)濾，沖洗液選擇0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液300 mL、600 mL和1000 mL三個(gè)梯度沖洗，在最后一次沖洗液中加入1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌液，搖勻過(guò)濾，取膜貼于瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。甲硝唑膜［7］，取10 mL 1∶10供試液薄膜過(guò)濾，沖洗液選擇pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液100 mL、300 mL和500 mL三個(gè)梯度沖洗，在最后一次沖洗液中加入1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌液，搖勻過(guò)濾，取膜貼于瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

2.3.2 菌液組 取與試驗(yàn)組中相同稀釋濃度的各株菌懸液1 mL，測(cè)定其菌落數(shù)。每個(gè)菌株平行制備2個(gè)平皿，計(jì)算平均菌落數(shù)。

2.3.3 供試液對(duì)照組 取與試驗(yàn)組同一供試品溶液，按2.3.1方法，不加菌液，測(cè)定供試液本底菌落數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對(duì)照組 取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，按2.3.1方法測(cè)定菌落數(shù)。

2.3.5 計(jì)算公式 試驗(yàn)組菌落數(shù)回收率(%)=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試液對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%，稀釋劑對(duì)照組菌數(shù)回收率(%)=稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%

2.4 驗(yàn)證菌檢查法

2.4.1 試驗(yàn)組 常規(guī)法 復(fù)方維 A酸膜，取10 mL 1∶10供試液和1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌液加至100 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。薄膜過(guò)濾法:復(fù)方慶大霉素膜和維A酸膜博膜過(guò)濾沖洗方法同2.3.1。

2.4.2 陰性對(duì)照組 取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液代替供試液，按2.4.1方法操作。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù) 分別測(cè)定3種供試品的回收率，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，稀釋劑對(duì)照組回收率均高于70%。由表1可知，復(fù)方維A酸膜無(wú)抑菌作用，可采用常規(guī)法檢查;復(fù)方硫酸慶大霉素膜對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制作用，采用薄膜過(guò)濾法，0.1%無(wú)菌蛋白胨緩沖液沖洗(1000 mL/膜)各驗(yàn)證菌回收率能達(dá)到70%以上;甲硝唑膜為抗厭氧菌制劑，采用薄膜過(guò)濾法，pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗(500 mL/膜)，各驗(yàn)證菌回收率能達(dá)到70%以上。

3.2 驗(yàn)證菌檢查 由表2可知，復(fù)方維A酸膜可采用常規(guī)法檢查驗(yàn)證菌，復(fù)方慶大霉素膜和甲硝唑膜由于抑菌的作用較強(qiáng)，只能采用薄膜過(guò)濾法檢查，沖洗液與沖洗量與細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)相同。

表1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌的驗(yàn)證回收率(%，n=3)

表2 驗(yàn)證菌檢查方法的驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

膜劑是藥物與適宜的成膜材料經(jīng)加工制成的膜狀制劑［8］。復(fù)方維A酸膜、復(fù)方慶大霉素膜和甲硝唑膜所使用的成膜材料均為聚乙烯醇17-88，都是水溶性膜［9］，可直接用45℃ pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解。

甲硝唑膜對(duì)厭氧菌有較強(qiáng)的抑菌作用，采用梯度設(shè)置沖洗液沖洗量，當(dāng)沖洗劑的沖洗量達(dá)到500 mL/膜時(shí)，驗(yàn)證菌株的回收率能達(dá)到70%。復(fù)方慶大霉素膜使用薄膜過(guò)濾沖洗時(shí)，pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液的沖洗量達(dá)到1000 mL/膜仍無(wú)法消除其抑菌性，改用0.1%蛋白胨緩沖液，沖洗量達(dá)到1000 mL/膜后，驗(yàn)證菌株的回收率能達(dá)到70%。

［1］ 人民軍醫(yī)出版社.中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范(2002年版)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2003:2.

［2］ 鐘 燕，孫永瀛.維A酸聯(lián)合塞來(lái)昔布治療口腔白斑的臨床研究［J］.中國(guó)臨床研究，2015，28(2):230-232.

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［4］ 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.中華人民共和國(guó)藥典(2010年版)二部［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:1.

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