張心悅，武海萍，朱逍遙，侯晶晶，卜 瑩

復方維A酸膜、復方硫酸慶大霉素膜和甲硝唑膜是《中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范》(2002)版［1］收載的醫(yī)院常用外用口腔制劑。其中，復方維A酸膜無抑菌性，有促進表皮細胞增生分化作用，用于口腔白斑及扁平苔蘚等治療［2］;復方硫酸慶大霉素膜有抑菌性，能夠消炎、止痛，促進黏膜創(chuàng)面，多用于口腔潰瘍治療;甲硝唑膜是抗厭氧菌藥膜，用于治療厭氧菌感染引起的牙周炎等口腔炎癥［3］。經(jīng)過文獻查新，目前尚未見這3種制劑微生物限度檢查方法的報道，為有效控制醫(yī)院制劑質(zhì)量，本文按《中國藥典》2010年版二部［4］規(guī)定進行微生物限度方法學驗證，并建立了這3種醫(yī)院外用口腔膜劑的微生物限度檢查方法。

1 試藥與儀器

1.1 供試品 復方維A酸膜(第四軍醫(yī)大學提供，批號:130801、130811、130820);復方硫酸慶大霉素膜(第四軍醫(yī)大學提供，批號:130814、130819、130803);甲硝唑膜(第四軍醫(yī)大學提供，批號:20131016、20130824、20131102)。

1.2 儀器設備 JY10001電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司);HP型電熱恒溫培養(yǎng)箱(沈陽利港凈化設備有限公司);SP-150A生化培養(yǎng)箱(南京恒裕儀器設備制造有限公司);SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司);SX-500高壓蒸汽滅菌器(日本Tomy Digital Biology公司);HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);HTY-300微生物過濾支架、一次性無菌過濾器(杭州泰林生物技術設備有限公司)等。

1.3 驗證菌株 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］;白色念珠菌［CMCC(F)98001］;枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］;黑曲霉菌［CMCC(F)98003］;大腸埃希菌［CMCC(B)44102］;銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］，均由中國食品藥品檢定研究院提供，傳代次數(shù)均不超過5代。

1.4 培養(yǎng)基和稀釋劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號:121226);玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號:130105);改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號:121123);改良馬丁培養(yǎng)基(批號:130118);營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號:121213);膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號:130106);甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號:121030);溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號:1109282);pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:130426)，均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

2 驗證方法

2.1 菌液制備 取35℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，稀釋制成含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液。取25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，稀釋制成含酵母菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液。取25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉真菌斜面培養(yǎng)物，用5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，并稀釋制成為50～100 cfu/mL的孢子液。

2.2 供試液制備 取供試品各100 cm2，加45℃pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，浸泡、振搖，使充分分散均勻，作為1∶10供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證［5］

2.3.1 試驗組 常規(guī)法:復方維A酸膜，無抑菌性可采用常規(guī)法。取1 mL 1∶10供試液和1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌液注入一個平皿中，培養(yǎng)基澆碟、培養(yǎng)。每個試驗菌株制備2個平皿，培養(yǎng)完畢后計菌落數(shù)，取平均值。薄膜過濾法:復方硫酸慶大霉素膜［6］，取 10 mL 1∶10 供試液薄膜過濾，沖洗液選擇0.1%無菌蛋白胨水溶液300 mL、600 mL和1000 mL三個梯度沖洗，在最后一次沖洗液中加入1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌液，搖勻過濾，取膜貼于瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計數(shù)。甲硝唑膜［7］，取10 mL 1∶10供試液薄膜過濾，沖洗液選擇pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液100 mL、300 mL和500 mL三個梯度沖洗，在最后一次沖洗液中加入1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌液，搖勻過濾，取膜貼于瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計數(shù)。

2.3.2 菌液組 取與試驗組中相同稀釋濃度的各株菌懸液1 mL，測定其菌落數(shù)。每個菌株平行制備2個平皿，計算平均菌落數(shù)。

2.3.3 供試液對照組 取與試驗組同一供試品溶液，按2.3.1方法，不加菌液，測定供試液本底菌落數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對照組 取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，按2.3.1方法測定菌落數(shù)。

2.3.5 計算公式 試驗組菌落數(shù)回收率(%)=(試驗組平均菌落數(shù)－供試液對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%，稀釋劑對照組菌數(shù)回收率(%)=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%

2.4 驗證菌檢查法

2.4.1 試驗組 常規(guī)法 復方維 A酸膜，取10 mL 1∶10供試液和1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌液加至100 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。薄膜過濾法:復方慶大霉素膜和維A酸膜博膜過濾沖洗方法同2.3.1。

2.4.2 陰性對照組 取pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液代替供試液，按2.4.1方法操作。

3 結果

3.1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 分別測定3種供試品的回收率，進行3次平行試驗，稀釋劑對照組回收率均高于70%。由表1可知，復方維A酸膜無抑菌作用，可采用常規(guī)法檢查;復方硫酸慶大霉素膜對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌有較強的抑制作用，采用薄膜過濾法，0.1%無菌蛋白胨緩沖液沖洗(1000 mL/膜)各驗證菌回收率能達到70%以上;甲硝唑膜為抗厭氧菌制劑，采用薄膜過濾法，pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗(500 mL/膜)，各驗證菌回收率能達到70%以上。

3.2 驗證菌檢查 由表2可知，復方維A酸膜可采用常規(guī)法檢查驗證菌，復方慶大霉素膜和甲硝唑膜由于抑菌的作用較強，只能采用薄膜過濾法檢查，沖洗液與沖洗量與細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)相同。

表1 細菌、霉菌及酵母菌的驗證回收率(%，n=3)

表2 驗證菌檢查方法的驗證結果

4 討論

膜劑是藥物與適宜的成膜材料經(jīng)加工制成的膜狀制劑［8］。復方維A酸膜、復方慶大霉素膜和甲硝唑膜所使用的成膜材料均為聚乙烯醇17-88，都是水溶性膜［9］，可直接用45℃ pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解。

甲硝唑膜對厭氧菌有較強的抑菌作用，采用梯度設置沖洗液沖洗量，當沖洗劑的沖洗量達到500 mL/膜時，驗證菌株的回收率能達到70%。復方慶大霉素膜使用薄膜過濾沖洗時，pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液的沖洗量達到1000 mL/膜仍無法消除其抑菌性，改用0.1%蛋白胨緩沖液，沖洗量達到1000 mL/膜后，驗證菌株的回收率能達到70%。

［1］ 人民軍醫(yī)出版社.中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范(2002年版)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2003:2.

［2］ 鐘 燕，孫永瀛.維A酸聯(lián)合塞來昔布治療口腔白斑的臨床研究［J］.中國臨床研究，2015，28(2):230-232.

［3］ 楊再永.我軍陸軍口腔健康和衛(wèi)生勤務保障現(xiàn)狀及對策［J］.東南國防醫(yī)藥，2013，15(6):612-614.

［4］ 中國醫(yī)藥科技出版社.中華人民共和國藥典(2010年版)二部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:1.

［5］ 楊宗學，陳 麗，姚 青，等.復方地恩酚軟膏的微生物方法驗證［J］.東南國防醫(yī)藥，2011，13(4):302-304.

［6］ 劉 英，王立萍.慶大霉素組分和有關物質(zhì)對效價的影響［J］.中國抗生素雜志，2012，37(2):127-131.

［7］ 余曉霞，邱凱鋒，劉春霞.新唑漱口液微生物限度檢查方法的驗證［J］.海峽藥學，2014，26(10):51-53.

［8］ 邱小玲，林 綏，闕慧卿.涂膜劑的研究概述［J］.海峽藥學，2009，21(8):16-18.

［9］ 鄭健鴻，林燕月.治療潰瘍膜材料和載藥膜材料的檢測指標［J］.中國組織工程研究，2013，17(3):536-543.