王 閏，孟 慧，許 勇

復(fù)方甘草軟膏是我院的自制制劑，主要成分為甘草提取物及鹽酸多塞平，用于蕁麻疹、濕疹、過(guò)敏性皮炎、神經(jīng)性皮炎及其引起的皮膚瘙癢，臨床療效較好?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，甘草中皂甙類(lèi)成分具有腎上腺皮質(zhì)激素樣作用和抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)等作用［1-3］;鹽酸多塞平是傳統(tǒng)的三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多塞平尚有很強(qiáng)的抗H1與H2受體作用，其拮抗H1受體的作用較傳統(tǒng)的抗組胺藥苯海拉明強(qiáng)100倍［4］，臨床上新用于治療相關(guān)的皮膚?。?-7］。我院根據(jù)甘草提取物和鹽酸多塞平藥理作用，設(shè)計(jì)組方制備了復(fù)方甘草軟膏，在臨床取得了較好的療效。為了保證醫(yī)院制劑的質(zhì)量，確保臨床用藥安全，本文建立了復(fù)方甘草軟膏鑒別方法及含量測(cè)定方法。

1 試劑與儀器

甘草提取物(上海滬豐生物科技有限公司，藥用，批號(hào):20120306)，鹽酸多塞平(上海滬豐生物科技有限公司，藥用，批號(hào):20120515)，甘草對(duì)照藥材(新疆參茸中藥飲片有限公司提供，批號(hào):12032203)，鹽酸多塞平對(duì)照品(上海西問(wèn)實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào):20120408)，甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110731-201116)，甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，乙腈(色譜純，美國(guó) SIGMAALDRICH公司)，紫外分光光度儀(Lambda 14，美國(guó)Perkin Elmer公司)，Waters高效液相色譜儀(515型單元泵+2487型紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 復(fù)方甘草軟膏的制備 稱(chēng)取硬脂酸100 g、單硬脂酸甘油酯75 g、16醇20 g、18醇20 g、白凡士林50 g、羊毛脂20 g，混合加熱融化，保持溫度80℃;另取甘油50 g、三乙醇胺8 g、吐溫-80 5 g、尼泊金甲酯1 g、尼泊金乙酯1 g加純化水100 mL加熱溶解，保持溫度80℃，在攪拌下緩緩加入到上述油相中，繼續(xù)攪拌乳化形成基質(zhì);將鹽酸多塞平50 g溶解在80℃ 165 mL純化水中，再加入甘草提取物250 g調(diào)成糊狀后與上述基質(zhì)混合，加入氮酮15 g和N-甲基吡咯烷酮15 g，攪拌均勻，待降溫至40℃，將30 g薄荷腦溶于30 g液體石蠟中，再以等量遞加法分次加入到以上混合物中，攪拌均勻至室溫既得。

2.2 復(fù)方甘草軟膏的鑒別 破乳:取適量的復(fù)方甘草軟膏于100 mL燒杯中，加10%氯化鈉溶液10 mL、甲醇40 mL，水浴加熱熔化，加入冰浴中10 min，破乳提取后再經(jīng)濾紙濾入100 mL的容量瓶中，取下濾紙放入燒杯中;再加入10%氯化鈉溶液5 mL、甲醇20 mL，水浴加熱熔化后，加入冰浴中10 min，再次破乳提取，合并濾入100 mL的容量瓶中。取下濾紙放入燒杯中，此次只加入20 mL甲醇溶液，同法濾入至100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.1 甘草的鑒別 取甘草對(duì)照藥材1 g，加乙醚40 mL，加熱回流1h，濾過(guò)，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)殖蓛煞?，一份用甲醇溶解，一份用水溶解作為兩組對(duì)照;與樣品提取液一同點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上，以正丁醇-濃氨試液-水-乙醇(13∶1∶4∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色，于紫外燈下檢視，并計(jì)算比移值(Rf值)。

2.2.2 鹽酸多塞平的鑒別 取鹽酸多塞對(duì)照品10 mg于100 mL量瓶中，加入10%氯化鈉溶液15 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照。

取復(fù)方甘草軟膏0.5 g于100 mL燒杯中，以1 mol/L HCL-甲醇溶液為溶劑，10%氯化鈉溶液進(jìn)行破乳提取，與甘草提取方法相同，提取鹽酸多塞平，作為樣品。另取未加鹽酸多塞平，只加等量甘草提取物的同基質(zhì)軟膏，同法提取，作為樣品的空白校正。于波長(zhǎng)200～400 nm測(cè)定其紫外吸收，以及其在最高吸光度的吸收波長(zhǎng)。

2.3 含量測(cè)定方法

2.3.1 甘草酸的測(cè)定 色譜條件:色譜柱:Waters C18 柱(3.9 ×150 mm)，粒度:5 μm，柱溫:室溫，流動(dòng)相:乙腈-0.01 mol/L磷酸(30∶70)，流速:1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):252 nm，進(jìn)樣量:20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備:將甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，稀釋至刻度，冷藏備用。

樣品的制備:取復(fù)方甘草軟膏0.2 g于100 mL燒杯中，加入20 mL流動(dòng)相，10%氯化鈉5 mL，水浴加熱融化后，加入冰浴中10 min，破乳提取后經(jīng)有機(jī)濾膜濾入50 mL量瓶中，取濾膜放入燒杯加入15 mL流動(dòng)相，10%氯化鈉3 mL，水浴加熱至融化后加入冰浴中10 min，破乳提取后經(jīng)有機(jī)濾膜一并濾入50 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻備用。

將標(biāo)準(zhǔn)液分別配置為濃度為 1.25、6.25、12.5、25、50 μg/mL 的溶液，精密吸取20 μL 進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算回歸方程。

2.3.2 鹽酸多塞平的測(cè)定 色譜條件:色譜柱:Waters C18 柱(4.6 ×150 mm)，粒度:5 μm，柱溫:室溫，流動(dòng)相:甲醇-乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鈉(35∶20∶45)，用2.0 mol/L 磷酸調(diào) pH 至 2.5，流速:1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):290 nm，進(jìn)樣量:20 μL。

對(duì)照品的制備:將鹽酸多塞平對(duì)照品20 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，稀釋至刻度，冷藏備用。

樣品的制備:方法同2.3.1項(xiàng)下的樣品制備。

將對(duì)照品溶液分別配置為濃度為1.25、6.25、12.5、25、50 μg/mL 的溶液，精密吸取 20 μL 進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算回歸方程。

精密吸取濃度為12.5 μg/mL的甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和多塞平對(duì)照品溶液20 μL，分別在其色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察測(cè)定方法的精密度;精密吸取濃度為12.5 μg/mL的甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和多塞平對(duì)照品溶液20 μL，分別在其色譜條件下，于 0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，測(cè)定甘草酸和多塞平的峰面積，計(jì)算其RSD，考察測(cè)定方法的穩(wěn)定性;取復(fù)方甘草軟膏(批號(hào)20140310)，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液6份，分別在不同色譜條件下，求得甘草酸和多塞平的峰面積，計(jì)算其RSD，考察測(cè)定方法的重復(fù)性。

3 結(jié)果

3.1 乳膏的制備 所制備品為棕色軟膏，氣微香。

3.2 復(fù)方甘草軟膏的鑒別

3.2.1 甘草薄層色譜(TLC)鑒別 復(fù)方甘草軟膏中的甘草成分使用薄層色譜法進(jìn)行鑒定。如圖1所示，軟膏樣品的 Rf=1.5/7.5=0.2，對(duì)照藥材(甲醇、水)的 Rf=1.5/7.5=0.2，根據(jù)薄層色譜的結(jié)果，表明制備的軟膏中含有甘草成分。

圖1 甘草鑒定的播出色譜圖

3.2.2 多塞平的紫外鑒別 多塞平對(duì)照品和復(fù)方甘草軟膏的紫外掃描分別見(jiàn)圖2、圖3，多塞平對(duì)照品和樣品均在298 nm處有特征的紫外吸收，參考文獻(xiàn)中多塞平在297 nm處有最大的紫外吸收［8］，根據(jù)紫外掃描圖譜，表明制備的軟膏中含有多塞平成分。在軟膏樣品進(jìn)行紫外掃描時(shí)需排除甘草成分的干擾，因此同法制備只含甘草成分的軟膏(不含多塞平)，進(jìn)行破乳提取，作為樣品測(cè)定時(shí)的空白對(duì)照。

圖2 多塞平對(duì)照品紫外－可見(jiàn)掃描圖譜

圖3 軟膏樣品紫外－可見(jiàn)掃描圖譜

3.3 含量測(cè)定方法

3.3.1 甘草酸和多塞平的測(cè)定 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品及軟膏樣品的高壓液相(HPLC)圖譜見(jiàn)圖4、圖5，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程:y=50 152x+12 391(r=0.9996)，線性范圍為 1.25 ～50 μg/mL。

多塞平對(duì)照品及軟膏樣品的HPLC圖譜見(jiàn)圖6、圖7，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程:y=32 367x+674 630(R=0.9995)，線性范圍為1.25 ～50 μg/mL。

精密度實(shí)驗(yàn)，甘草酸和多塞平的RSD分別為0.78%和1.04%;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，甘草酸和多塞平的RSD分別為0.75%和1.06%;重復(fù)性實(shí)驗(yàn);甘草酸和多塞平的RSD分別為1.13%，1.45%。表明該測(cè)定方法符合要求。

圖4 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜

圖5 甘草酸樣品的HPLC圖譜

圖6 多塞平對(duì)照品的HPLC圖譜

圖7 多塞平樣品的HPLC圖譜

3.3.2 樣品測(cè)定 參考《中國(guó)藥典》中相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定本品1g軟膏中甘草酸不得少于16.2 mg，多塞平的含量應(yīng)為45～55 mg。取三組不同批號(hào)的軟膏，測(cè)定甘草酸和多塞平的含量，結(jié)果見(jiàn)表1，均符合規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

表1 復(fù)方甘草軟膏中甘草酸和多塞平的含量(mg/g軟膏)

4 討論

考慮到軟膏中成分復(fù)雜，在測(cè)定甘草酸含量時(shí)，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相極性延長(zhǎng)了保留時(shí)間，從而排除干擾，達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)定的目的［9］。在測(cè)定多塞平時(shí)，選擇了與測(cè)定甘草酸不同的流動(dòng)相，文獻(xiàn)報(bào)道多塞平存在異構(gòu)體［10］，色譜可能出現(xiàn)雙峰。依照相關(guān)文獻(xiàn)［11-12］，采用 2.0 mol/L 磷酸調(diào)流動(dòng)相的 pH 至2.5，取得了較好的結(jié)果。

關(guān)于復(fù)方甘草軟膏中甘草酸和多塞平的含量的標(biāo)準(zhǔn)，參考了《中國(guó)藥典》中復(fù)方甘草片及鹽酸多塞平片的含量標(biāo)準(zhǔn)。復(fù)方甘草片的藥典標(biāo)準(zhǔn)為每片含甘草浸膏粉112.5 mg，含甘草酸不得少于7.3 mg;而每克軟膏中含有甘草提取物250 mg，根據(jù)復(fù)方甘草片中含甘草浸膏粉的量，折算得每克軟膏中甘草酸不得少于16.2 mg，而測(cè)定的三批制劑，每克軟膏中甘草酸都大于16.2 mg。鹽酸多塞平片的藥典標(biāo)準(zhǔn)為每片含多塞平應(yīng)為標(biāo)示量的90% ～110%，根據(jù)軟膏制備時(shí)的投藥量，每克軟膏中多塞平的標(biāo)示量為50 mg，即每克軟膏中多塞平的含量應(yīng)為45～55 mg，而測(cè)定的三批制劑，每克軟膏中多塞平的含量均在標(biāo)示量的90%～110%。本文所制定的含量標(biāo)準(zhǔn)可以更好地控制軟膏的質(zhì)量，保證臨床的療效。

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