李 超，王玉英，王冬冬，范丹丹，王 平，紀鴻翔，尹燕博

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東 青島 266101）

引起幼貂大量死亡的肺炎克雷伯菌的分離和鑒定

李 超1，王玉英1，王冬冬1，范丹丹1，王 平2，紀鴻翔2，尹燕博1

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東 青島 266101）

采用西蒙式枸櫞酸鹽瓊脂培養(yǎng)基從山東威海地區(qū)肺出血死亡幼貂的肺臟和肝臟中分離到1株細菌，對所分離的細菌進行形態(tài)特征、理化性質(zhì)、16S rRNA測序鑒定，并對該分離菌進行了藥敏試驗和人工感染試驗。結果顯示，該菌16S rRNA序列與GeneBank登錄號為CP006648的肺炎克雷伯菌16S rRNA序列同源性為95%，分離菌具有高度的耐藥性，對小鼠具有較強致病作用，并可復制出與水貂類似的病理變化，由此推斷肺炎克雷伯菌是導致幼貂大量死亡的主要致病菌。

水貂；肺炎克雷伯菌；分離鑒定

水貂克雷伯?。∕ink klebsiellosis）是由肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn）引起的，以膿腫、蜂窩織炎、麻痹和膿毒敗血癥為特征的傳染病[1]。Kpn為革蘭陰性菌，屬于腸桿菌科（Enterobaeteriaceae）克雷伯菌屬（klebsiella），是動物呼吸道和腸道內(nèi)的寄生性條件致病菌，正常條件下極少侵害家畜，只有在特殊情況下如免疫功能低下或長期使用抗菌藥物時，能致動物的肺炎、子宮炎、乳腺炎及其他化膿性炎癥，偶爾能引起敗血癥[2]。

革蘭陰性菌、特別是一些毒力較弱的機會致病菌已經(jīng)嚴重地威脅著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，并給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[3]。隨著山東省特種經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，細菌感染已成為影響其發(fā)展的重要因素。近年來，胡本剛[3]、楊艷玲[4]、鐘世勛[6]等相繼報道了從感染病死水貂中分離鑒定出了肺炎克雷伯菌。

本文根據(jù)山東省威海地區(qū)3家規(guī)?；躔B(yǎng)殖場送檢病死幼貂的發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化，結合細菌的分離鑒定和動物實驗，推測導致幼貂以肺臟出血為特征，并造成大規(guī)模死亡的原因為肺炎克雷伯菌感染。

1 材料與方法

1.1 病料采集 剖檢病死水貂，可見胸腔積液，肺臟出血，肝臟稍發(fā)黃、輕度腫大，腸道臌氣，無菌采集病死幼貂的肺臟、肝臟等臟器。

1.2 試劑材料 西蒙式枸櫞酸鹽瓊脂（SCA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基等，購自青島高科園海博生物技術有限公司；藥物敏感紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；微量生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；其他試劑材料均由青島澳蘭百特生物工程有限公司診斷中心提供。

1.3 細菌分離培養(yǎng)和形態(tài)學觀察 將病料按常規(guī)方法接種于半合成瓊脂培養(yǎng)基中，37℃需氧和厭氧培養(yǎng)24 h。挑取單菌落，再劃線接種于SCA固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征和大小，挑選典型菌落連續(xù)純化3代。對分離的菌株進行革蘭染色，在光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài)和染色特性，以40%甘油生理鹽水于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生化特性鑒定 分離菌株分別接種于含有枸櫞酸鹽、尿素酶、木糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、β-半乳糖苷酶、甘露醇、肌醇等微量生化試管，37℃培養(yǎng)1～7 d，觀察和記錄試驗結果。

1.5 藥敏試驗 挑取單個菌落接種TSB肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h。將其用滅菌棉簽均勻涂布于普通營養(yǎng)瓊脂平板，稍干后再用無菌鑷子將藥敏紙片貼在普通營養(yǎng)瓊脂平板表面，37℃培養(yǎng)24 h后測量各藥物抑菌圈的大小，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷分離菌株對各種藥物的敏感程度。

1.6 分子生物學鑒定 提取分離純化病原菌的基因組DNA，參考細菌16S rRNA通用引物F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R1492：5′-TAC?GGTACCTTGTTACGACTT-3′[7]，進行16S rRNA PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pMD19-T連接，轉化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選挑取白色菌落，進行菌液PCR鑒定，選取陽性克隆樣品送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。獲得的基因序列通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進行基因序列同源性比對，確定病原菌種屬。

1.7 小鼠致病力試驗 將分離純化的細菌采用平板計數(shù)法確定注射菌液的活菌濃度約為4×109個/mL。將該菌TSB純培養(yǎng)液0.2mL腹腔接種體重約20 g的BALB/c小鼠10只，另設5只小鼠作正常對照，僅腹腔接種0.2mL無菌生理鹽水，觀察小鼠發(fā)病和死亡情況，按照上述方法從死亡小鼠肺臟和肝臟中再次進行細菌分離及鑒定。

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察 分離獲得在半合成培養(yǎng)基上形成淺白色半透明、圓形凸起、邊緣齊整的光滑型菌落。在西蒙式枸櫞酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（SCA）上形成較小的藍色菌落，菌落位置培養(yǎng)基由綠色變成藍色。顯微鏡觀察分離菌為兩極濃染的革蘭陰性粗短桿菌。

2.2 生化鑒定結果 分離菌可分解大多數(shù)糖類，可利用枸櫞酸鹽和肌醇，生化反應結果符合克雷伯菌的特性，見表1。

表1 分離菌的生化鑒定結果

2.3 藥敏試驗結果 該分離菌是1株多重耐藥株，對恩諾沙星、氟苯尼考、卡那霉素等多種抗生素呈現(xiàn)高度耐藥，僅對先鋒派酮、頭孢西丁中度敏感，結果見表2。

表2 分離菌的藥敏試驗結果

2.4 PCR鑒定及序列比對結果 對分離菌株16S rRNA基因進行擴增，擴增出約1.5 kb的片段（見圖1）。將分離菌株所測16S rRNA基因序列與GenBank中已收錄核酸數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索，經(jīng)比對后確

定菌株為肺炎克雷伯菌，與登錄號為CP006648的肺炎克雷伯菌16S rRNA序列同源性為95%。

圖1 16S rRNA目的基因的PCR電泳結果M：DL-2 000DNAMarker；1：分離菌擴增產(chǎn)物

2.5 分離菌株的致病性試驗結果 結果顯示，注射后對照組全部正常，試驗組接種細菌培養(yǎng)物24 h內(nèi)共死亡9只，小鼠在6 h后開始發(fā)病，表現(xiàn)為精神不振，全身哆嗦，擠堆嗜睡，食欲減退。剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)腸道臌氣；肺臟出血；肝臟稍發(fā)黃，輕度腫大（見中插彩版圖2）。剖檢后用肺臟和肝臟涂片、鏡檢，結果檢出大量革蘭陰性桿菌，經(jīng)鑒定為肺炎克雷伯菌。從攻毒組小鼠體內(nèi)再次分離到了細菌，鑒定結果與從水貂體內(nèi)分離得到肺炎克雷伯菌一致。

3 討論

本實驗從病原學角度對山東省威海地區(qū)幼貂急性大規(guī)模死亡的病因進行了探究和分析。細菌學檢查結果表明，從病死貂的心血和內(nèi)臟實質(zhì)器官通過細菌分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢、生化試驗以及16S rRNA基因測序等試驗對該病原菌進行鑒定，證實該病原菌為水貂肺炎克雷伯菌，藥敏試驗結果表明，該病原菌僅對先鋒派酮、頭孢西丁中度敏感；對絕大多數(shù)抗菌藥物高度耐藥，因而表明，該分離病原菌為強耐藥菌株。以一定劑量的菌液腹腔接種BALB/c小鼠進行動物回歸試驗，結果表明，該分離株具有強致病性，致死率到90%，并成功復制出與病死水貂相似的病理變化，診斷該病為肺炎克雷伯菌引起的水貂出血性肺炎。

本試驗采用西蒙式枸櫞酸鹽瓊脂培養(yǎng)基進行肺炎克雷伯菌的純化，只有利用枸椽酸鹽作為惟一碳源的肺炎克雷伯菌才能在SCA培養(yǎng)基上生長，大腸桿菌一般不能生長，在該培養(yǎng)基上肺炎克雷伯菌呈較小的藍色菌落[8]。將SCA培養(yǎng)基用于臨床肺炎克雷伯菌的分離鑒定，將使細菌學診斷更快速、準確。

當前，抗生素臨床治療時的不合理使用以及廣泛用于促生長的飼料添加藥物，使肺炎克雷伯菌產(chǎn)生了嚴重的耐藥性，且多數(shù)分離株都為多重耐藥菌株，在治療上造成極大的困擾。機體的抵抗力下降和飼養(yǎng)管理水平低下都可能引起條件性致病菌克雷伯菌病的發(fā)生，因此應加強飼養(yǎng)管理，創(chuàng)造良好的養(yǎng)殖環(huán)境以減少細菌病尤其是條件性致病菌病的發(fā)生，減少經(jīng)濟損失。毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)不斷朝著集約化方向發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷增大，肺炎克雷伯菌的致病作用在不斷的增強，本病在臨床上危害應引起足夠的重視。

[1]趙占民.動物傳染病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1996：266．

[2]陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：237．

[3]胡本剛，杜崇濤，雷連成，等.貂源肺炎克雷伯菌的分離與鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報，2011，33（8）：598-600．

[4]楊艷玲，陳峙峰，王成福.水貂肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].特產(chǎn)研究，2012（4）：10-12．

[5]CN-WS.紙片法抗菌藥物敏感試驗標準[S]1999.

[6]鐘世勛，朱瑞良，崔國林，等.山東部分地區(qū)毛皮動物肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2013，35（4）：285-288．

[7]何衛(wèi)新，康立超，楊華，等.羔羊肺炎病原分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2013，49（4）：37-39．

[8]鐘世勛.肺炎克雷伯氏菌的系統(tǒng)發(fā)育分析及其微膠囊疫苗的研制[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2013.

Isolation and identification on K lebsiella pneumoniaewhich was bacterial pathogen leading to disease of M inks

LIChao1，WANGYu-ying1，WANGDong-dong1，F(xiàn)ANDan-dan1，WANG Ping2，JIHong-xiang2，YIN Yan-bo1
（1.College of Animal Scienceand Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Qingdao OLand-Better Bioengineering Co.，Ltd，Qingdao 266101，China）

A pathogenic bacteria stain was isolated from the young died minks due to hemorrhagic pneumonia by Simmons Ci?trate Agarmedium from Weihai Shandong province.The isolated bacteria were identified by themethods ofmorphological charac?teristics，physicochemical properties and 16S rRNA sequencing.Antibiotic sensitivity test and artificial infection test about the iso?lated bacteria were also performed.The result revealed that 16S rRNA gene of the strain shared the homology of 95%with refer?ence strain of GeneBank accession number CP006648 Klebsiella pneumoniae.Antibiotic sensitivity test revealed that the strain was highly unsensitive tomost of antibiotics.Experimental infection test indicated that the bacterium had high pathogenicity tomice and could replicate and cause pathological changes similar to those inminks.The strain was isolated and identified as Klebsiella peneumoniae which was the bacterial pathogen leading to disease ofminks.

Mink；Klebsiella peneumoniae；Isolation and identification

YIN Yan-bo

S852.16+2

A

0529-6005（2015）11-0027-03

2014-07-31

李超（1989-），男，碩士生，從事動物傳染病診斷研究，E-mail：lichao07115614@126.com

尹燕博，E-mail：yanboyin2011@163.com