陶金忠，趙國順，趙興緒，胡俊杰，張 勇

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.天水市動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 天水 741600；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

阿拉善雙峰駝卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

陶金忠1，趙國順2，趙興緒3，胡俊杰3，張 勇3

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.天水市動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 天水 741600；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

為了比較阿拉善雙峰駱駝卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，根據(jù)卵泡直徑將顆粒細(xì)胞分為兩類，利用雙向電泳技術(shù)構(gòu)建阿拉善雙峰駱駝顆粒細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳圖譜，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，以3倍以上的表達(dá)變化用PDQuest 8.0軟件比較這兩類顆粒細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異。結(jié)果共檢測到了12個差異點，經(jīng)MALDI TOF/TOF-MS/MS鑒定發(fā)現(xiàn)它們是12種不同的蛋白質(zhì)。其中丙酮酸脫氫酶E1、annexin A2可能與顆粒細(xì)胞能量代謝有關(guān)，這為阿拉善雙峰駱駝顆粒細(xì)胞的研究奠定了理論依據(jù)。

阿拉善雙峰駱駝；二維電泳；蛋白質(zhì)組學(xué)；顆粒細(xì)胞

阿拉善雙峰駝是國家二級保護(hù)動物，其生殖特點與大多數(shù)哺乳動物不同的是它的排卵方式為誘導(dǎo)排卵[1]。顆粒細(xì)胞增殖分化是卵泡發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，其是由原始卵泡中的卵泡細(xì)胞在卵泡發(fā)育的初級卵泡階段形成的，顆粒細(xì)胞的分化過程也是卵泡的發(fā)育過程。顆粒細(xì)胞通過合成多種激素及生長因子，并表達(dá)其受體來調(diào)控卵母細(xì)胞的生長、排卵以及卵泡的啟動、發(fā)育和閉鎖[2]。如雌激素受體α、褪黑素等多種蛋白質(zhì)通過顆粒細(xì)胞調(diào)節(jié)生殖生理機(jī)能。蛋白質(zhì)組學(xué)可以讓人們從蛋白質(zhì)整體水平理解顆粒細(xì)胞，目前并沒有關(guān)于顆粒細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的報道。因此，我們根據(jù)卵泡的大小將顆粒細(xì)胞分為兩類，用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找不同大小卵泡中顆粒細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的差異，從而為探索雙峰駝卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞生理機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 樣品采集與制備 于西寧屠宰場采集宰殺后阿拉善駝的卵巢，共24個，置于加有雙抗的37℃生理鹽水中帶回實驗室。將卵巢用滅菌的生理鹽水

沖洗后，按照卵泡的直徑將其分為兩類（d≤10mm；d＞10mm），然后在無菌條件下用1mL注射器吸取卵泡液，均勻混合。將卵泡液10 000 r/min（4℃）離心5min棄去上清，用100μL的PBS沖洗后10 000 r/min（4℃）離心5min，棄上清，加入100μL的蛋白質(zhì)裂解液，置于液氮罐中反復(fù)冷凍10次，常溫溶解后，渦旋30 s。Bradford法定量。

1.2 雙向電泳 具體步驟參照Bio-Rad蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳實驗操作手冊。

將樣品與上樣緩沖液混合后，100 00 r/min（4℃）離心10 min。設(shè)置等電聚焦程序：50 V，14 h（主動水化）；250 V（線性），1 h；1 000 V（線性），1 h；9 000 V（線性），6 h；9 000 V（線性），80 000 Vh；500 V（快速），任意時間。第一項結(jié)束后分別用6mL的膠條平衡緩沖A液和6mL的膠條平衡緩沖B液平衡15 min。然后用12%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，設(shè)置電泳程序：50 V，1 h；然后調(diào)至200 V，待溴酚藍(lán)線距離玻璃板下沿1 cm時停止電泳。

1.3 差異點質(zhì)譜檢測 經(jīng)染色后脫色的凝膠用掃描議掃描。再用PDQuest8.0軟件以蛋白表達(dá)譜上“斑點染色強(qiáng)度和面積三倍量的變化”為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異分析，檢測差異蛋白點。然后切取差異蛋白點，在脫色和胰酶消化后，用MALDI-TOF/ TOF-MS分析，用Mascot軟件搜索NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，蛋白質(zhì)的C.I.得分大于95%則認(rèn)為此蛋白有意義。

2 結(jié)果

2.1 凝膠電泳圖譜分析 用雙向電泳技術(shù)建立了阿拉善雙峰駝顆粒細(xì)胞蛋白質(zhì)的2-DE圖譜（圖1）。以3倍以上的表達(dá)變化用PDQuest8.0軟件從這兩種卵泡的顆粒細(xì)胞中共檢測到了12個差異蛋白點（如圖1）。其中，點7，9，10，11，12只在大卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，點1，6只在小卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，其他的蛋白點在兩類卵泡的顆粒細(xì)胞中都有表達(dá)。點2，3，4，5隨著卵泡的增大而減少，點8隨著卵泡的增大而增多。

圖1 阿拉善駝不同大小卵泡顆粒細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)2-DE圖譜A：卵泡直徑小于等于10mm；B：卵泡直徑大于10mm；1～12：是差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點的編號

2.2 質(zhì)譜鑒定 用MALDITOF/TOF-MS/MS鑒定12個差異蛋白點，發(fā)現(xiàn)它們是12種蛋白質(zhì)（如表1），點1是血紅蛋白α，點2是線粒體型的ETHE1前體，點3是線粒體內(nèi)的丙酮酸脫氫酶E1β亞基，點4是硫代硫酸硫基轉(zhuǎn)移酶，點5是annexin A2，點6是細(xì)胞角蛋白8，點7是一種假想蛋白，點8是血紅蛋白β，點9是蛋白激酶C，點10是COMM區(qū)域包含蛋白10樣蛋白，點11是線粒體內(nèi)膜蛋白獨立島1，點12是28S核糖體蛋白S18b。這些蛋白含量的變化在圖2中詳細(xì)說明。

3 討論

3.1 丙酮酸脫氫酶E1β亞基 丙酮酸脫氫酶是線粒體內(nèi)能量代謝的限速酶，催化生物體內(nèi)丙酮酸轉(zhuǎn)變成乙醘輔酶A，從而參與三大營養(yǎng)物的最終代謝。其主要包括三類：E1、E2和E3；E1是由E1α和E1β各兩個單位組成的四聚體，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)丙酮酸脫氫酶E1β亞基在小鼠精子獲能過程中發(fā)生酪氨酸磷酸化，對于精子獲能過程中糖酵解的調(diào)節(jié)起到一定作用[3]。NandiS 1等[4]研究發(fā)現(xiàn)，隨著卵泡直徑的增加，葡萄糖濃度也隨之增加，說明個體較大卵泡需要更多葡萄糖，葡萄糖的需求量增加除了從增加外界攝入外，可能還需要抑制某些機(jī)體內(nèi)葡萄糖的分解過程。并且還發(fā)現(xiàn)在卵泡內(nèi)存在特異的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體GLUT1和GLUT4[5]，說明葡萄糖確實作為能量物質(zhì)參與卵泡發(fā)育。我們發(fā)現(xiàn)在大卵泡中的顆粒細(xì)胞內(nèi)丙酮酸脫氫酶E1β亞基的含量少于小卵泡的顆粒細(xì)胞，這可能是隨著第3期卵泡的不斷增大，顆粒細(xì)胞的增殖不斷放慢，需要的能量也不斷減少的原因。

表1 MALDITOF/TOF-MS/MS鑒定的顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)

圖2 阿拉善駝不同大小卵泡顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)的含量變化

3.2 annexin A2 annexin A2是annexin家族的成員之一，annexins有20多個成員，大多數(shù)都與生殖有關(guān)。annexin A2是一種纖溶酶受體，與細(xì)胞的增殖、凋亡有關(guān)，具有RNA結(jié)合的特性，還與DNA合成、復(fù)制有關(guān)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，annexin A2和其配體S100A10的基因在小鼠多種組織中都有表達(dá)，在卵巢和子宮等生殖器官中表達(dá)水平尤為高[7]。通過RNA干擾和抗體干擾的方法表明，Annexin A2參與依賴胰島素的GLUT-4的跨膜轉(zhuǎn)運，并影響葡糖糖的轉(zhuǎn)化[8]。對雙峰駝的研究發(fā)現(xiàn)，大卵泡的顆粒細(xì)胞中的annexin A2含量低于小卵泡。而小卵泡需要更多的葡糖糖來增值，所以，可以推測Annexin A2的增多主要是為了滿足跨膜轉(zhuǎn)運更多的葡糖糖。但是，目前發(fā)現(xiàn)，GLUT-4只在肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中表達(dá)。因此，Annexin A2是否通過GLUT-4調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞內(nèi)的能量代謝還有待研究。

4 結(jié)論

本文首次通過研究不同直徑卵泡中顆粒細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組學(xué)，建立顆粒細(xì)胞二維電泳圖譜，經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)丙酮酸脫氫酶E1、annexin A2可能與顆粒細(xì)胞的能量代謝有關(guān)。

[1]趙興緒.駱駝的生態(tài)生理及繁殖[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1995.

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Com parative proteom iesstudy of Alax Bactrian CamelG ranulosa Cells between the different periodsof follicular development

TAO Jin-zhong1，ZHAOGuo-shun2，ZHAO Xing-xu3，HU Jun-jie3，ZHANG Yong3
（1.Agricultural College，Ningxia University，Yinchuan 750021，China；2.Tianshuianimal Disease Prevention and Control Center，Tianshui741600，China；3.College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

The aim of this study was to identify differentially expressed proteins in the granulosa cells of Alax Bactrian Camel during follicular development.Granulosa cellswere divided into two groups according to their diameter.2-dimensional gel electro?phoresis（2-DE）was performed to analyze the granulosa cell samples.Differential proteinswere detected by PDQuest 8.0 software after stained with commassie blue.12 differentially expressed spots were observed.These spots were identified by MALDI TOF/ TOF-MS/MS.12 unique proteinswere be found.We hypothesize that pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta and an?nexin A2 play a role in the energy metabolism of granulosa cells.This study provides a solid basis for further study on granulosa cells of Alax Bactrian Camel.

two-humped Camel；proteomic analysis；follicular development；2-DE

ZHAO Xing-xu

Q 958.1

A

0529-6005（2015）11-0003-03

2015-03-24

國家自然科學(xué)基金項目（31001095）

陶金忠（1977-），男，副教授，博士，從事動物生殖生理、動物繁殖障礙、蛋白組學(xué)研究，E-mail：tao_jz@nxu.edu.cn

趙興緒，E-mail：zhaoxx@gsau.edu.cn