鄧 翀， 韓 磊， 張亞強， 姜 祎

（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西咸陽712046；2.陜西國際商貿(mào)學院，陜西咸陽712046）

杜仲鹽制前后化學成分的變化

鄧 翀1， 韓 磊2， 張亞強1， 姜 祎1

（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西咸陽712046；2.陜西國際商貿(mào)學院，陜西咸陽712046）

目的 比較杜仲鹽制前后化學成分的差異，推測其炮制原理。方法 采用紫外分光度結(jié)合HPLC-UV法比較鹽制杜仲前后飲片中總氨基酸、總黃酮、總多糖以及京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷這4種化學成分含有量的差異。結(jié)果 與生品相比，杜仲鹽制品中總氨基酸的含有量增加了24.232%，總多糖增加了78.169%，總黃酮降低了16.129%，而京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷這4種化學成分的含有量分別降低了50.663%、21.925%、18.410%、32.923%。結(jié)論 杜仲鹽制的原理可能是增加總氨基酸和總多糖的溶出，或改變各化學成分群的配比關(guān)系。

杜仲；鹽制；化學成分；紫外分光度；HPLC-UV

1 實驗材料

1.1 儀器 UV-1102紫外分光光度計、FA2004N電子分析天平 （上海天美科學儀器有限公司）；SG250HPT超聲波清洗器 （上海冠特超聲儀器有限公司）；Waters2695 HPLC色譜儀（美國Waters公司）；BT224S電子天平 （賽多利斯科學儀器北京有限公司）。

1.2 試藥 杜仲 （略陽縣嘉木杜仲產(chǎn)業(yè)有限公司），經(jīng)陜西中醫(yī)學院藥學院王繼濤教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliver.的干燥樹皮。谷氨酸 （批號 200501）、D-葡萄糖 （批號200503）、京尼平苷 （批號11041701）、京尼平苷酸 （批號10032101）對照品 （純度均大于98%，供含有量測定用，天津西瑪科技有限公司）；蘆?。ㄅ?號 0080-9705）、綠 原酸 （批 號 110753-200413）、松脂醇二葡萄糖苷 （批號 111537-200502）對照品 （中國食品藥品檢定研究院）。乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；水為純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取谷氨酸5.00 mg、蘆丁11.4 mg、D-葡萄糖對照品5.02 mg，置于25 mL量瓶中定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.200、0.456、0.201 mg/mL的對照品溶液。

精密稱取京尼平苷4.9 mg、京尼平苷酸4.7 mg、綠原酸3.3mg、松脂醇二葡萄糖苷對照品4.5 mg，乙醇定容于10 mL量瓶中，得到京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為0.490、0.470、0.330、0.450 mg/m L的對照品溶液，4℃下保存。

2.2 樣品溶液的制備 杜仲鹽制飲片按照文獻［3］報道的方法炮制。將炮制飲片和生品粉碎，過60目篩，分別精密稱取炮制前后的飲片粉末2 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加70%乙醇30 mL，80℃下水浴回流提取2次，每次1 h。然后，提取液在80℃水浴中揮干，殘渣用70%乙醇溶解，定容到25 m L量瓶中，4℃下保存，用于測定總黃酮及HPLC多成分的含有量。

再精密稱取飲片粉末2 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加10倍量95%乙醇，80℃水浴回流1 h后濾過，重復(fù)1次，干燥濾渣。然后，將殘渣置于50 mL圓底燒瓶中，加10倍量水，90℃水浴中提取1 h，重復(fù)1次，提取液在90℃水浴中揮干，殘

渣用純凈水溶解，定容到25 mL量瓶中，4℃下保存，用于測定總氨基酸及總多糖的含有量。

2.3 總氨基酸、總黃酮、總多糖測定方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察 分別精密量取谷氨酸對照品溶液0.28、0.35、0.42、0.49、0.56 mL，置于10 m L具塞試管中，按照文獻 ［4］報道的方法測定，數(shù)據(jù)進行計算分析，得到標準曲線 Y= 7.242 9X-0.16，r=0.999 1，表明谷氨酸對照品在0.056～0.112 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

分別精密量取蘆丁對照品溶液 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 m L，置于10 mL具塞試管中，按照文獻 ［5］報道的方法測定，數(shù)據(jù)進行計算分析，得到標準曲線Y=0.437 3X+0.03，r=0.999 9，表明蘆丁對照品在0.456～1.368 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

分別精密量取D-葡萄糖對照品溶液0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mL，置于10 mL具塞試管中，按照文獻 ［6］報道的方法測定，數(shù)據(jù)進行計算分析，得到標準曲線Y=11.13X-0.003 4，r=0.999 6，表明D-葡萄糖對照品在0.024 096～0.056 224 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗 分別精密量取谷氨酸、蘆丁、D-葡萄糖對照品溶液適量，置于10 m L具塞試管中，按 “2.3.1”項下方法測定，重復(fù)6次，RSD均小于2.00%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同批次杜仲生品2 g，按 “2.2” 項下方法制備樣品溶液，按“2.3.1”項下方法于0、10、20、30、40、50、60 min測定其吸光度。結(jié)果表明，氨基酸、黃酮、多糖在樣品溶液中60 min內(nèi)的穩(wěn)定性均良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同批次杜仲生品粉末6份，按 “2.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.3.1”項下方法測定樣品中氨基酸、黃酮、多糖的含有量。結(jié)果，三者RSD均小于2.50%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率試驗 精密稱取同批次含有量已知的杜仲生品6份，精密加入谷氨酸、蘆丁和葡萄糖對照品溶液適量，按照 “2.3”項下方法測定，計算回收率。結(jié)果，三者的平均回收率分別為97.7%、98.8%、98.1%，RSD分別為2.25%、1.76%、1.22%，表明回收率良好。

2.4 HPLC法測定京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷

2.4.1 色譜分析條件 Thermo-C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～7 min，7%A；7～45 min，14%A；45～50 min，15%A）；檢測波長235 nm；柱溫30℃，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品及樣品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of m ixed reference substances and sam p Ies

2.4.2 標準曲線的制備 精密吸取混合對照品溶

液2、4、6、8、10μL進樣，在 “2.4.1”項色譜條件下測定，以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標 （Y）繪制標準曲線，得到回歸方程，分別為京尼平苷Y=8X-12 648，r=0.999 3；京尼平苷酸Y=8×104X+55 112，r=0.999 5；綠原酸Y=8X-14 532，r=0.999 5；松脂醇二葡萄糖苷Y=8×104X+42 325，r=0.999 7。由此可知，京尼平苷在9.8×10-4～4.9×10-3mg，京尼平苷酸在9.4×10-4～4.7×10-3mg，綠原酸在6.6×10-4～3.3×10-3mg，松脂醇二葡萄糖苷9×10-4～4.5×10-3mg范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗 精密量取同一混合對照品溶液10μL，在 “2.4.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，進樣量10μL，測定峰面積。結(jié)果，RSD值分別為京尼平苷0.93%、京尼平苷酸1.99%、綠原酸1.25%、松脂醇二葡萄糖苷1.18%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同批次杜仲生品6份，按 “2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，在 “2.4.1”項色譜條件下測定。結(jié)果，RSD值分別為京尼平苷酸0.94%、綠原酸1.09%、京尼平苷2.04%、松脂醇二葡萄糖苷1.13%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同批次杜仲生品5份，按 “2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下分別于0、2、4、6、8 h內(nèi)進樣，測定峰面積。結(jié)果，RSD值分別為京尼平苷酸1.97%、綠原酸1.30%、京尼平苷1.38%、松脂醇二葡萄糖苷1.16%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取同批次含有量已知的杜仲生品粉末6份，每份1 g，分別精密加入京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷對照品約3.5、1、0.5（對照品溶液）、2.5 mg，按 “2.2”項下方法制備樣品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下測定，結(jié)果見表1，表明回收率良好。

2.5 樣品含有量的測定 按 “2.2”項下方法制備杜仲生品及炮制品供試品溶液6份，按“2.3.1”項下方法測定杜仲鹽制前后樣品中氨基酸、多糖、黃酮的含有量，在 “2.4.1”項色譜條件下測定杜仲鹽制前后樣品中京尼平苷酸、綠原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷的含有量。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Resu It of recovery tests（n=6）

3 結(jié)果

3.1 杜仲鹽制前后飲片中總氨基酸、總黃酮、總多糖的含有量 與生品相比，杜仲炮制后氨基酸和多糖的含有量明顯上升，但總黃酮有所下降，結(jié)果見表2。由表可知，杜仲炮制后，氨基酸含有量增加24.232%，總多糖增加78.169%，而總黃酮降低16.129%。

表2 杜仲鹽制前后飲片中總氨基酸、總黃酮、總多糖的含有量（n=6）Tab.2 Con tents of totaIam ino acids，totaI fIavonoids and tota IpoIysaccharides in decoction pieces of Eucommia ulmoides before and after being processed with saIt（n=6）

3.2 杜仲鹽制前后飲片中京尼平苷、京尼平苷酸、

綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含有量 與生品相比，杜仲炮制后京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含有量均有不同程度的下降，結(jié)果見表3。由表可知，杜仲炮制后，這4種成分的含有量分別降低了 50.663%、21.925%、18.410%、32.923%。

表3 杜仲鹽制前后飲片中京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含有量（n=6）Tab.3 Contents of geniposide，geniposidic acid，ch Iorogenic acid and pinoresinoI gIucose in decoction pieces of Eucomm ia ulmoides before and after being processed w ith saIt（n=6）

4 討論

杜仲炮制的溫度一般在160～200℃之間［7］，但隨著溫度進一步升高，其化學成分組成將發(fā)生變化，其中鹽炙后，杜仲飲片中松脂醇二葡萄糖苷、京尼平、京尼平苷、京尼平苷酸、咖啡酸、綠原酸、槲皮素的含有量相對于生品而言，均有所降低［8-9］。本實驗以氨基酸、多糖、黃酮總化學部位，以及松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸多成分含有量為評價指標，比較鹽制杜仲前后化學成分的變化，發(fā)現(xiàn)除氨基酸和多糖總含有量升高以外，其它成分的含有量均呈降低趨勢，與文獻報道一致。

由此推測，可能是由于杜仲中某些大分子成分穩(wěn)定性較差，部分化學鍵在加熱時易發(fā)生斷裂，生成小分子物質(zhì)，而加入鹽后會影響反應(yīng)體系的離子強度，從而促進或抑制杜仲中某些有效成分之間的相互轉(zhuǎn)化，在高溫條件下，黃酮類成分會發(fā)生水解、氧化和裂解反應(yīng)，導(dǎo)致其化學成分含有量呈降低趨勢。杜仲炮制后會導(dǎo)致木脂素苷類成分的糖苷鍵斷裂，而木脂素類成分的苷元顯著增加，而且環(huán)烯醚萜類化合物在加熱條件下會發(fā)生氧化或聚合反應(yīng)，導(dǎo)致其含有量降低［10］。杜仲鹽制品中綠原酸的含有量降低，而阿魏醛升高，這可能是在加熱條件下，綠原酸裂解生成咖啡酸和奎尼酸，而咖啡酸發(fā)生脫水反應(yīng)生成阿魏醛［10］。鹽會影響細胞的傳熱傳質(zhì)性能，從而使杜仲在炮制時更易受到破壞，有效成分更易溶出，從而提高其極性化學成分氨基酸和多糖的提取率［11］。

另外，前期腎陽虛藥效學研究顯示，杜仲鹽制品的作用優(yōu)于生品［12］。根據(jù)文獻及本實驗結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)鹽制能改變杜仲中大多數(shù)化學成分的結(jié)構(gòu)，增加親脂性，從而促進其體內(nèi)吸收入血，提高體內(nèi)生物利用度。由此可知，杜仲 “鹽炙入腎”，增強其補腎功效的原理可能是鹽炙可使杜仲化學成分由極性向非極性轉(zhuǎn)化，增加親脂性，從而提高其生物利用度。

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Changes of chem icaIconstituents in Eucomm iae cortex before and after processed w ith saIt

DENG Chong1， HAN Lei2， ZHANG Ya-qiang1， JIANG Yi1

（1.Shaanxi University of Ghinese Medicine，Xianyang 712046，Ghina；2.Shaanxi Gommerce Gollege，Xianyang 712046，Ghina）

AIM To compare the differences in chemical constituents in Eucommiae cortex before and after being processed with salt and speculate its processing principle.METHODS UV spectrophotometric and HPLC-UV were used to compare the differences in the contents of total amino acids，total flavonoids，total polysaccharides，geniposidic，geniposidic acid，chlorogenic acid and pinoresinol diglucoside.RESULTS Compared with raw Eucommiae cortex，the contents of total amino acids and total polysaccharides were increased by 24.232%and 78.169%，the content of total flavonoidswas decreased by 16.129%，and the contents of geniposidic，geniposidic acid，chlorogenic acid and pinoresinol diglucoside were decreased by 50.663%，21.925%，18.410%and 32.923%in salt products，respectively.CONCLUSION The principle of Eucommiae cortex processed with salt is likely to enhance the dissolutions of total amino acids and total polysaccharides or change the proportions of chemical component groups.

Eucommiae Gortex；processed with salt；chemical constituents；UV spectrophotometric；HPLC-UV杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliver.的干燥樹皮，其主要功效成分為木脂素、環(huán)烯醚萜類、黃酮類等，具有補肝腎、強筋骨、降血壓、抗腫瘤、安胎等諸多功效，《中國藥典》2010年版規(guī)定，杜仲飲片為生杜仲和鹽杜仲。一般認為，杜仲炮制可使其 “斷絲”，有利于煎煮和粉碎等，其中加鹽炒制后可引藥入腎治下，增強杜仲補肝腎、降壓作用。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)和藥理活性研究引入傳統(tǒng)中醫(yī)藥，人們對杜仲炮制工藝進行了廣泛深入的研究［1-2］，但一般都只對某一種單一的炮制方式進行工藝篩選，缺乏系統(tǒng)性和統(tǒng)一化，評價指標不夠全面。因此，本實驗對鹽制杜仲炮制前后化學成分進行系統(tǒng)的比較，為評價其炮制原理、控制其飲片質(zhì)量，及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

R283

A

1001-1528（2015）11-2464-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.028

2015-04-07

陜西省自然科學基金項目 （2010JQ4022）；陜西省教育廳自然科學專項 （2010JK501）

鄧 翀 （1978—），男，博士，副教授，研究方向為中藥炮制化學及原理研究。Tel：（029）38185165，E-mail：fmmudz217 @126.com