徐 穎，樊明濤，冉軍艦，程拯艮，戚一曼

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；3.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

不同品種蘋(píng)果籽總酚含量與抗氧化相關(guān)性研究

徐 穎1,2，樊明濤1,*，冉軍艦3，程拯艮1，戚一曼1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；3.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

為探討蘋(píng)果籽總酚含量與抗氧化相關(guān)性及其抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，以7 個(gè)品種蘋(píng)果籽為材料，采用 Folin-Ciocalteu法測(cè)定總酚含量，F(xiàn)RAP法、ABTS+·法、 O2－·清除法、·OH清除法和DPPH自由基清除法評(píng)價(jià)抗氧化活性，高效液相色譜法進(jìn)行多酚成分分析。結(jié)果表明：7 個(gè)品種蘋(píng)果籽總酚含量范圍為5.74～17.44 mg GAE/g（以干質(zhì)量計(jì)），抗氧化性?xún)?yōu)于茶多酚、VC和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT），蜜脆蘋(píng)果籽具有最高的總酚含量和最好的抗氧化能力。除DPPH自由基清除法外，多酚含量與其他4 種方法測(cè)得的抗氧化數(shù)據(jù)具有顯著正相關(guān)（r=0.771～0.984）。根皮苷為蘋(píng)果籽多酚抗氧化的主要成分。

蘋(píng)果籽；總酚；抗氧化；相關(guān)性

蘋(píng)果籽是蘋(píng)果渣的主要成分之一，對(duì)蘋(píng)果渣進(jìn)行烘干、分離處理，可得到大量干蘋(píng)果籽。我國(guó)是世界上蘋(píng)果產(chǎn)量最大的國(guó)家之一，年產(chǎn)量約3 500萬(wàn) t，其中30%左右用于果汁果醬加工。按鮮果與產(chǎn)生果渣的比例約為5∶1[1]推算，每年產(chǎn)生果渣約200萬(wàn) t，蘋(píng)果籽約2.4萬(wàn) t。蘋(píng)果籽營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白含量34%，脂肪含量27.7%[2]，還含有多酚類(lèi)物質(zhì)。蘋(píng)果多酚（apple polyphenols，AP）是蘋(píng)果次生代謝產(chǎn)物，是蘋(píng)果中所含多元酚類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，蘋(píng)果籽多酚的種類(lèi)豐富，主要有二氫查爾酮類(lèi)（dihydrochalcones）、對(duì)羥基肉桂酸類(lèi)（hydroxycinnamic acids）、黃烷-3-醇類(lèi)（flavan-3-ols）和黃酮醇類(lèi)（flavonols）。含量較高的物質(zhì)有根皮苷（phloridzin）、綠原酸（chlorogenic acid）、原花青素B2（procyanidin B2）和表兒茶素（epicatechin）[3-4]。蘋(píng)果多酚可以通過(guò)清除氧自由基而保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的影響[5-6]。此外，還可作為還原劑、氫供體以及金屬螯合劑起到抗氧化的作用[7]。目前，市場(chǎng)上出現(xiàn)了添加葡萄籽提取物、石榴籽提取物的化妝品，對(duì)蘋(píng)果籽進(jìn)行加工利用，同樣具有可觀(guān)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

體外抗氧化活性的測(cè)定方法有鐵離子還原法（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）、ABTS+·清除法、O2－·清除法、·OH清除法、DPPH自由基清除法等。本實(shí)驗(yàn)采用上述幾種方法綜合評(píng)價(jià)蘋(píng)果籽多酚的抗氧化性。目前，研究蘋(píng)果皮抗氧化性的文獻(xiàn)[8-11]報(bào)道較多，但是對(duì)蘋(píng)果籽抗氧化性的研究較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)7 種蘋(píng)果籽總酚含量及其體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，探討其相關(guān)性及抗氧化機(jī)制，為蘋(píng)果籽多酚的加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取具有代表性的7 個(gè)蘋(píng)果品種，分別為秦陽(yáng)、紅蓋露、黃元帥、紅星、蜜脆、富士和秦冠，其中秦陽(yáng)、紅蓋露為早熟品種，黃元帥、紅星和蜜脆為中熟品種，富士和秦冠為晚熟品種。樣品均為采自種于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場(chǎng)的10 年生蘋(píng)果樹(shù)的成熟果實(shí)。

根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.8%）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，C18H12N5O6，相對(duì)分子質(zhì)量394.3）；三吡啶三吖嗪（2,4,6-tri（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ，C18H16，相對(duì)分子質(zhì)量312.34）；2,2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2’-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid）diammonium salt，ABTS，C18H24N6O6S4，相對(duì)分子質(zhì)量548.68）；Folin-酚試劑；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）；色譜甲醇；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜（含1525二元泵，2998雙通道紫外檢測(cè)器，2707自動(dòng)進(jìn)樣器，Breeze色譜管理軟件等）美國(guó)Waters公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Büchi公司；cp2245型分析天平 德國(guó)Sartorius 公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；KQ-2500E型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)有限公司；UV-2800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g蘋(píng)果籽樣品于研缽中，加10 mg VC防止氧化，加入30 mL甲醇，充分研磨，轉(zhuǎn)移到100 mL三角瓶中，超聲提取30 min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃條件下濃縮至干，用甲醇溶解殘留物定容至10 mL，此為蘋(píng)果籽多酚樣品液，過(guò)0.45 μm濾膜，用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析蘋(píng)果籽多酚組成，同時(shí)用于總酚含量測(cè)定和抗氧化活性分析。取0.2 g VC，用水定容至100 mL，取0.1 mL用水定容至10 mL，此時(shí)VC溶液質(zhì)量濃度為20 μg/mL。取0.2 g BHT，用甲醇定容至100 mL，取0.1 mL用甲醇定容至10 mL，此時(shí)BHT溶液質(zhì)量濃度為20 μg/mL。以20 μg/mL VC和20 μg/mL BHT溶液作為對(duì)照。

1.3.2 總酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定總酚含量[12]。取0.5 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液與5 mL蒸餾水混合，再加入1 mL的Folin-Ciocalteu反應(yīng)液。室溫下放置 10 min 后與 3 mL 15% Na2CO3溶液混合均勻，避光反應(yīng)2 h，于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蒸餾水為空白對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程：y=0.120 8x+0.002 1（R2=0.999 8）?？偡雍恳詻](méi)食子酸計(jì)，單位為mg GAE/g（以干質(zhì)量計(jì)，下同）。

1.3.3 色譜條件[13]

色譜柱為Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A：體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸水溶液，流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫時(shí)間程序：0～10 min，5%～30% B；10～25 min，30%～50% B；25～35 min，50%～70% B；35～40 min，70%～5% B；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

1.3.4 體外抗氧化活性測(cè)定

采用FRAP法測(cè)定，參照Benzie等[14]的方法；ABTS+·清除率測(cè)定，參照Re等[15]的方法；O2－·清除率測(cè)定，參照聶凌鴻等[16]的方法；·OH清除率測(cè)定，參照李艷伏等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0 Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析，Duncan法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 7 種蘋(píng)果籽總酚含量

圖1 7種蘋(píng)果籽總酚含量Fig.1 Total polyphenol contents of apple seed extracts of seven cultivars

由圖1可知，密脆籽的總酚含量最高，為17.44 mg GAE/g，顯著高于其他品種，其他品種總酚含量按照由高到低順序依次為紅蓋露、富士、紅星、秦冠、秦陽(yáng)，黃元帥最低（5.74 mg GAE/g），僅為密脆籽總酚含量的1/3。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 總還原力和4 種自由基清除能力

圖27 種蘋(píng)果籽多酚的還原力和自由基清除能力Fig.2 Reducing power and radical scavenging activity of apple seed polyphenols of seven cultivars

由圖2A可知，7 種蘋(píng)果籽多酚的總還原能力在0.729～2.725 mmol FeSO4/g（以干質(zhì)量計(jì)，下同）。密脆籽多酚總還原能力顯著高于其他品種，紅蓋露、富士、紅星、秦冠次之，黃元帥、秦陽(yáng)較弱。由圖2B可知，7 種蘋(píng)果籽多酚的ABTS+·清除率為37.14%～90.86%。蜜脆籽多酚的清除率顯著高于其他品種，紅星、秦冠、富士、秦陽(yáng)次之，紅蓋露、黃元帥較弱。由圖2C可知，7 種蘋(píng)果籽多酚的O2－·清除率為16.10%～80.32%。蜜脆籽多酚的清除率顯著高于其他品種，秦陽(yáng)、秦冠次之，富士、紅星、紅蓋露、黃元帥較弱。由圖2D可知，7 種蘋(píng)果籽多酚的·OH清除率為9.49%～53.62%。蜜脆籽多酚的清除率顯著高于其他品種，富士、秦冠、紅蓋露次之，黃元帥、秦陽(yáng)、紅星較弱。由圖2E可知，蘋(píng)果籽多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果均較好，除紅星外，其余6 個(gè)品種的清除率均在90%以上，差異不顯著。蜜脆、紅蓋露籽多酚的清除率最高，其余依次為秦陽(yáng)、富士、黃元帥、秦冠、紅星。

2.2.2 蘋(píng)果籽多酚與3 種抗氧化劑清除自由基能力比較

自由基清除率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的抗氧化劑的濃度即半抑制濃度（IC50），可以評(píng)價(jià)其抗氧化能力[18]。由表1可知，蘋(píng)果籽多酚對(duì)ABTS+·、O2－·、·OH 3 種自由基的清除能力約是茶多酚的4 倍，對(duì)DPPH自由基的清除能力約是茶多酚的10 倍；蘋(píng)果籽多酚對(duì)4 種自由基清除能力依次是VC的8.7、28.6、16.8、17.7 倍，依次是BHT的30、60、31、117 倍。因此，蘋(píng)果籽多酚的抗氧化能力明顯優(yōu)于茶多酚、VC和BHT。

表1 蘋(píng)果籽多酚與3 種抗氧化I劑IC50Table 1 IC50of apple seed polyphenols and three antioxidants μg/mL

2.3 蘋(píng)果籽總酚含量與抗氧化性相關(guān)分析

表2 蘋(píng)果籽總酚含量與抗氧化性相關(guān)分析Table 2 Correlation between total phenolic content and antioxidant Table 2 Correlation between total phenolic content and antioxidant activity of apple seeds ds

由表2可知，總酚含量和FRAP值在0.01水平極顯著正相關(guān)，除DPPH自由基清除率外，總酚含量和其他3 種方法所得的自由基清除率在0.05水平顯著正相關(guān)。因此在以后的蘋(píng)果籽抗氧化評(píng)價(jià)中，可以通過(guò)測(cè)定多酚含量來(lái)初步預(yù)測(cè)其抗氧化能力，這樣能大幅度減少實(shí)驗(yàn)工作量。

2.4 蘋(píng)果籽多酚抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)

圖3 蜜脆蘋(píng)果籽多酚高效液相色譜Fig.3 Chromatograms of Honeycrisp apple seed polyphenols

以蜜脆蘋(píng)果籽多酚色譜圖為例，其余品種未列出，由圖3可知，蘋(píng)果籽多酚主要有根皮苷、金絲桃苷、綠原酸、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、5-阿魏酸、槲皮素等，其中含量最多的多酚是根皮苷，7 個(gè)品種中，根皮苷含量占總酚含量的79.76%～86.67%，說(shuō)明根皮苷是蘋(píng)果籽主要的多酚物質(zhì)和抗氧化成分。

3 討 論

根皮苷屬于二氫查爾酮類(lèi)，是根皮素的葡萄糖苷，Lu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，根皮苷約占蘋(píng)果籽多酚的75%，F(xiàn)romm等[3]研究發(fā)現(xiàn)，根皮苷占蘋(píng)果籽單體多酚的79%～92%。Lu等[20]對(duì)蘋(píng)果渣多酚抗氧化及自由基清除作用研究表明，根皮苷具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)DPPH自由基清除能力約為VE的2 倍，對(duì)超氧陰離子自由基清除能力約為VE的2.5 倍。本研究表明蘋(píng)果籽多酚的抗氧化性明顯優(yōu)于茶多酚、VC和BHT，這主要是以根皮苷為主的各種多酚協(xié)同作用的結(jié)果。多酚由于含有多羥基結(jié)構(gòu)，可以起清除自由基的作用，其機(jī)理主要有3 種[21]：一是提供氫原子給自由基，使自由基變成穩(wěn)定物質(zhì)，ArOH+R·→ArO·+RH；二是通過(guò)電子轉(zhuǎn)移使自由基變成穩(wěn)定物質(zhì)，ArOH+R·→ArOH·++R－；三是螯合金屬離子，阻止金屬離子引發(fā)自由基反應(yīng)，H2O2+ Mn+→OH－+·OH+M（n+1）+。例如，多酚能夠供氫生成穩(wěn)定的物質(zhì)而將超氧陰離子自由基清除，通過(guò)電子轉(zhuǎn)移將DPPH自由基、ABTS+·清除，通過(guò)與Fe2+螯合，阻止Fe2+催化生成·OH的反應(yīng)而將羥自由基清除。

蜜脆是美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)園藝系以“Macoun”與“Honeygold”雜交培育而成的中熟蘋(píng)果新品種。2001年引入陜西，2006年12月通過(guò)陜西省果樹(shù)品種審定委員會(huì)審定并命名[22]。研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的7 個(gè)品種中，蜜脆蘋(píng)果籽具有最高的總酚含量和最好的抗氧化能力。蜜脆蘋(píng)果不僅口感甜脆，而且籽的抗氧化性能也很優(yōu)良，以后的生產(chǎn)實(shí)踐可以對(duì)密脆品種加以重視。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)的7 個(gè)品種蘋(píng)果籽多酚均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，蜜脆蘋(píng)果籽具有最高的總酚含量和最好的抗氧化能力。除DPPH自由基法外，多酚含量與FRAP值、ATBS+·清除率、O2－·清除率、·OH清除率具有顯著正相關(guān)性。根皮苷為蘋(píng)果籽多酚抗氧化的主要成分。蘋(píng)果籽多酚的抗氧化性?xún)?yōu)于茶多酚、VC和BHT，與人工合成的抗氧化劑相比，從蘋(píng)果籽中提取的多酚物質(zhì)作為安全天然、無(wú)毒的抗氧化劑，具有廣泛的應(yīng)用范圍和銷(xiāo)售市場(chǎng)，對(duì)保證食品質(zhì)量安全具有深遠(yuǎn)意義。

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Correlation between Total Phenolic Content and Antioxidant Activity in Apple Seeds from Seven Cultivars

XU Ying1,2, FAN Mingtao1,*, RAN Junjian3, CHENG Zhenggen1, QI Yiman1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China; 3. School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

This study aimed to investigate the correlation between the tota l phenolic content and antioxidant activity in apple seeds from seven cultivars. The total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteu method, the antioxidant activity was evaluated by total reducing capacity, 3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid diammonium salt (ABTS) scavenging, superoxide anion scavenging, hydroxyl free radical scavenging and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assays, and the pol yphenol composition of apple seeds was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). It was shown that Honeycrisp exhibited the highest total phenolic content and the best antioxidant properties among seven apple cultivars. Antioxidant activity of polyphenols in apple seeds was signifi cantly positively correlated with total phenolic content (r = 0.771–0.984), with the exception of DPPH scavenging capacity. Compared to tea polyphenols, vitamin C (VC) and 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT), apple seed polyphenols exhibited better antioxidant activity. Phloridzin, which accounted for 79.76%-86.67% of the total phenolic content as determined by HPLC, was the dominant antioxidant component in apple seeds. Polyphenols extracted from apple seeds could have a wide application prospect because they act as the safe, non-toxic natural antioxidants.

apple seeds; total phenolic; antioxidant; correlation

TS255.1

A

1002-6630（2015）01-0079-05

10.7506/spkx1002-6630-201501015

2014-03-11

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20130204110032）

徐穎（1978—），女，講師，博士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。 E-mail：xuying@sust.edu.cn

*通信作者：樊明濤（1963—），男，教授，博士，主要從事食品安全研究。E-mail：fanmt@nwsuaf.edu.cn