李向紅，劉永樂(lè)，俞 健，王發(fā)祥，王建輝，王滿(mǎn)生

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程系，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

精白保胚米發(fā)芽過(guò)程中米谷蛋白及其氨基酸的變化

李向紅，劉永樂(lè)*，俞 健，王發(fā)祥，王建輝，王滿(mǎn)生

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程系，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

研究精白保胚米發(fā)芽過(guò)程中米谷蛋白及其氨基酸組成的變化。精白保胚米在發(fā)芽過(guò)程中，淀粉含量呈下降趨勢(shì)，蛋白質(zhì)的含量略有上升；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和體積排阻色譜的結(jié)果顯示：發(fā)芽后米谷蛋白中含量較高的各亞基分子質(zhì)量沒(méi)有太大差別，但其含量有所變化，高分子質(zhì)量亞基含量減少，低分子質(zhì)量亞基含量增多。米谷蛋白氨基酸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)芽可以增加精白保胚米總氨基酸和必需氨基酸的含量，必需氨基酸組成模式更加合理。分析結(jié)果表明發(fā)芽可以提高精白保胚米的食用品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

精白保胚米；發(fā)芽；谷蛋白；氨基酸分析

研究表明，精白保胚發(fā)芽米食用品質(zhì)優(yōu)于精白保胚米、糙米和發(fā)芽糙米[1]，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有所提高[2]。精白保胚米發(fā)芽過(guò)程中，所含的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等被激活和釋放，各種淀粉酶的作用使得精白保胚米中淀粉含量下降，總糖和葡萄糖含量增加[2]；同時(shí)，精白保胚米中的蛋白質(zhì)也在蛋白酶的作用下發(fā)生了一系列的變化，影響了精白保胚米的食用品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前，對(duì)于發(fā)芽糙米的研究較多，對(duì)于精白保胚米發(fā)芽過(guò)程中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量以及氨基酸組分的變化尚未見(jiàn)報(bào)道；并且前人大都是對(duì)糙米米粉進(jìn)行氨基酸組分分析[3]，單獨(dú)對(duì)米谷蛋白氨基酸分析的報(bào)道很少。由于精白保胚米的蛋白質(zhì)主要是米谷蛋白，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)精白保胚米中米谷蛋白的亞基、氨基酸組成以及γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）的含量變化進(jìn)行了分析，為精白保胚發(fā)芽米產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)以及綜合利用提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精白保胚米的原料為東北粳稻（空育131），購(gòu)自黑龍江北大荒種業(yè)集團(tuán)有限公司。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（生化試劑純）、β-巰基乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴酚藍(lán) 汕頭市西隴化工廠(chǎng)有限公司；氫氧化鈉、濃鹽酸、十二烷基硫酸鈉、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白、丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺均為市售分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

精白保胚米制米機(jī)組 湖南省湘糧機(jī)械制造有限公司；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；UV2600 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰撕特儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SK-1型快速混勻器 金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)；LG10-24A高速離心機(jī) 北京金立離心機(jī)有限公司；FD-1真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；迷你型垂直電泳槽、YY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠(chǎng)；氨基酸自動(dòng)分析儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 精白保胚米發(fā)芽工藝

精白保胚米發(fā)芽工藝參考文獻(xiàn)[4]。

1.3.2 常規(guī)成分檢測(cè)

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法，氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為5.95[5]；淀粉含量的測(cè)定：硫酸-蒽酮法[6]；還原糖含量的測(cè)定：直接滴定法[7]；脂肪含量的測(cè)定：GB/T 5512—2008《糧油檢驗(yàn) 糧食中粗脂肪含量測(cè)定》中索氏抽提法[8]；水分含量的測(cè)定：GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法[9]。

1.3.3 米谷蛋白的提取

采用分步法提取米谷蛋白，工藝流程參考文獻(xiàn)[10]。

1.3.4 米谷蛋白分子質(zhì)量的測(cè)定

采用垂直板十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳法測(cè)定米谷蛋白分子質(zhì)量，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。以相對(duì)分子質(zhì)量64×104～14×104的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，樣品用0.05 mol/L NaOH預(yù)處理。電泳同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)R250染色5 h左右，脫色至電泳帶清晰即可。

1.3.5 米谷蛋白分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用體積排阻色譜-高效液相色譜（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）法測(cè)定米谷蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布。將米谷蛋白用磷酸鹽緩沖液（2% SDS，pH 7.0）溶解配制成5 mg/mL的分散液，8 000 r/min離心15 min后取上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，使用島津LC-20A高效液相系統(tǒng)與Shodex KW-804蛋白柱分析米谷蛋白樣品的分子質(zhì)量分布。流動(dòng)相為200 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（2% SDS，pH 7.0），洗脫速率1 mL/min，在280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫液，柱溫為20 ℃。

1.3.6 米谷蛋白氨基酸組分分析[11]

精密稱(chēng)取樣品0.05 g左右樣品于20 mL安培瓶中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸于酒精噴燈上封口，于110 ℃加熱12 h。取出冷后過(guò)濾，取0.2 mL于60 ℃水浴吹干，加入1.0 mL 流動(dòng)相溶解并轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，于12 000 r/min離心3 min，置于4 ℃條件下避光保存。取5 μL樣品于1.5 mL離心管中，加入50 μL衍生試劑，渦旋振蕩1 min。取20 μL注入氨基酸自動(dòng)分析儀。記錄色譜圖，計(jì)算峰面積，以樣品的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)的峰面積比較定量，以保留時(shí)間定性。

其中氨基酸評(píng)分（amino acid score，AAS）的計(jì)算公式為：

必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）的計(jì)算方法為：米谷蛋白的必需氨基酸含量與雞蛋蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量比值的幾何平均數(shù)。

1.3.7 γ-氨基丁酸含量的測(cè)定

色譜柱：Waters AccQ?TagTM氨基酸分析柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）。流動(dòng)相：流動(dòng)相A為140 mmol/L醋酸鈉加17 mmol/L三乙胺，用稀H3PO4調(diào)整pH值到5.02；流動(dòng)相B為乙腈；流動(dòng)相C為水。流速為1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)248.0 nm，柱溫37 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)成分分析

表1 大米主要成分含量分析Table 1 Proximate composition of different rice samples %

由表1可知，發(fā)芽可略微增加精白保胚米中蛋白質(zhì)的含量，大米蛋白中的氨基酸相比其他谷物蛋白來(lái)說(shuō)較平衡，易被消化吸收[12]，說(shuō)明發(fā)芽可以提高精白保胚米蛋白質(zhì)的生物利用率[13]。同時(shí)，發(fā)芽過(guò)程中，隨著α-淀粉酶和β-淀粉酶活力的不斷提高，淀粉不斷被降解為還原糖等物質(zhì)，淀粉含量有所減少，還原糖含量增加。

2.2 米谷蛋白分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果分析

2.2.1 SDS-PAGE

根據(jù)低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)以及用Gel-ProAnalyzer 4.5凝膠分析軟件對(duì)電泳圖進(jìn)行分析，得到各個(gè)泳道中蛋白帶的分子質(zhì)量與其相應(yīng)的積分光密度值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白各個(gè)蛋白帶的積分光密度值分析Table 2 Optical density of each protein band of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice

由表2可知，精白保胚米發(fā)芽后，米谷蛋白中含量較高的各亞基分子質(zhì)量沒(méi)有太大差別，而含量有所變化。其中分子質(zhì)量為64.4 kD和47.7 kD的部分其含量有所降低，這些部分對(duì)應(yīng)的是米谷蛋白中α和β亞基的聚集體[14-15]，發(fā)芽過(guò)程中，蛋白酶活性增大，使得蛋白質(zhì)聚集體分解為亞基，導(dǎo)致分子質(zhì)量較小的亞基含量增加，甚至生成部分氨基酸。前人研究發(fā)現(xiàn)，大米中清蛋白、球蛋白和米谷蛋白在陳化過(guò)程中均表現(xiàn)出高分子質(zhì)量部分含量增多，低分子質(zhì)量亞基含量減少的趨勢(shì)[16]，而大米陳化過(guò)程中其食用品質(zhì)有所下降，主要表現(xiàn)在米飯黏性的下降，可能與高分子質(zhì)量部分含量增多，低分子質(zhì)量亞基含量減少有關(guān)，因此精白保胚米發(fā)芽后食用品質(zhì)有所提高可能也與其高分子質(zhì)量部分含量減少，低分子質(zhì)量亞基含量增多有關(guān)。

2.2.2 SEC-HPLC

采用SEC-HPLC進(jìn)一步測(cè)定了米谷蛋白的分子質(zhì)量分布，見(jiàn)圖1。圖中所列數(shù)據(jù)為每個(gè)峰的相對(duì)峰面積。結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了SDS-PAGE的結(jié)果，保留時(shí)間為6.0 min左右的大分子質(zhì)量的部分隨著發(fā)芽的進(jìn)行逐級(jí)減少，伴隨著小分子質(zhì)量部分的增加，發(fā)芽24 h后，保留時(shí)間為9.0 min左右的部分增加較為明顯。

圖1 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白的體積排阻色譜Fig.1 SEC-HPLC of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice

2.3 米谷蛋白氨基酸組分變化分析

表3 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白氨基酸含量變化Table 3 Amino acid contents of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice g/100 g

由表3可知，精白保胚米及其發(fā)芽米的Leu、Ile、Met、Thr、Lys和Ser含量隨著發(fā)芽有所增加。由于谷蛋白中賴(lài)氨酸是第一限制氨基酸，因此通過(guò)發(fā)芽的方式可提高精白保胚米的蛋白質(zhì)質(zhì)量；同時(shí)，賴(lài)氨酸含量提高，有利于大米風(fēng)味改善[17]。Glu是精白保胚米及其發(fā)芽米的主要氨基酸，在發(fā)芽過(guò)程中谷氨酸脫羧酶被激活，以谷氨酸為底物脫去羧基生成GABA，其含量在發(fā)芽后大幅升高，由于每日補(bǔ)充微量的GABA有利于心腦血壓的緩解，促進(jìn)人體內(nèi)氨基酸代謝的平衡，調(diào)節(jié)免疫功能[18-19]，因此精白保胚米在發(fā)芽后營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有顯著提高；此外，精白保胚米內(nèi)的蛋白酶會(huì)水解部分蛋白質(zhì)生成一定量的谷氨酸。精白保胚米發(fā)芽過(guò)程中谷氨酸含量是下降的，可能原因是谷氨酸脫羧酶在發(fā)芽過(guò)程中占主導(dǎo)作用，強(qiáng)于蛋白酶的水解作用。

表4 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白必需氨基酸組成Table 4 Essential amino acid pattern of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice g/100 g

精白保胚米中米谷蛋白的必需氨基酸組成（表4）與FAO/WHO模式相比較，Leu、Phe+Tyr和Val含量高于模式值，Lys和Thr含量均要低，Ile含量接近于FAO/WHO模式。發(fā)芽后，Lys含量略微增加，Leu、Phe+Tyr值略降低，Ile含量接近于FAO/WHO模式，從而說(shuō)明精白保胚米在發(fā)芽后必需氨基酸（essential amino acid，EAA）組成模式比發(fā)芽前稍趨合理。

表5 精白保胚米及發(fā)芽米中米谷蛋白氨基酸評(píng)分和必需氨基酸指數(shù)Table 5 Amino acid scores and essential amino acid indexes of rice gluten in polished rice with intact germ and germinated rice

由表5可知，發(fā)芽后精白保胚米中Lys的AAS雖有增加，但仍是限制性氨基酸。發(fā)芽米的EAAI高于未發(fā)芽米，EAAI越大，表明蛋白質(zhì)的質(zhì)量和利用率越高，因此，發(fā)芽后精白保胚米的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)得到較大改善。

蛋白質(zhì)中氨基酸的組成特性對(duì)蛋白質(zhì)的品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生很大的影響。精白保胚米發(fā)芽后，限制性氨基酸如賴(lài)氨酸和蘇氨酸含量增加，部分氨基酸含量高于FAO/WHO推薦模式，與發(fā)芽綠豆結(jié)果一致[20]，表明發(fā)芽可以進(jìn)一步改善精白保胚米氨基酸的組成特性，顯著提高其蛋白質(zhì)品質(zhì)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從發(fā)芽過(guò)程中米谷蛋白的分子質(zhì)量及氨基酸組成變化的角度初步闡明了發(fā)芽對(duì)精白保胚米食用品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響。精白保胚米在發(fā)芽過(guò)程中，淀粉含量呈下降趨勢(shì)，蛋白質(zhì)的含量略有上升；發(fā)芽后米谷蛋白中含量較高的各亞基分子質(zhì)量沒(méi)有太大差別，而含量有所變化，高分子質(zhì)量亞基含量減少，低分子質(zhì)量亞基含量增多；發(fā)芽可以增加精白保胚米蛋白質(zhì)、總氨基酸和必需氨基酸的含量，必需氨基酸指數(shù)提高，與FAO/WHO模式相比，精白保胚發(fā)芽米的必需氨基酸組成模式稍趨合理，說(shuō)明通過(guò)發(fā)芽可以提高精白保胚米的食用品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，發(fā)芽處理是改造精白保胚米風(fēng)味、提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的有效途徑，為精白保胚米的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用開(kāi)辟了一條新的加工途徑。

[1] 伍君妮, 劉永樂(lè), 李向紅, 等. 精白保胚發(fā)芽米食用品質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(19): 161-165.

[2] 李向紅, 劉永樂(lè), 俞健, 等. 精白保胚米發(fā)芽過(guò)程中淀粉酶及相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分的變化[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(3): 37-40.

[3] 鄭藝梅, 李群, 華平. 發(fā)芽對(duì)糙米蛋白質(zhì)及氨基酸組成特性的影響[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2007, 22(5): 11-15.

[4] 張冬生, 劉永樂(lè), 李向紅, 等. 精白保胚發(fā)芽米淀粉的理化性質(zhì)[J].食品科學(xué), 2010, 31(17): 177-181.

[5] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB/T 5009.5—2010 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].

[6] 袁道強(qiáng), 黃建華. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)和技術(shù)[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2006: 126-132.

[7] 阮滿(mǎn)堂. 直接滴定法測(cè)定糖果中還原糖含量[J]. 輕工科技, 2012(7): 8-9.

[8] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB/T 5512—2008 糧食中粗脂肪含量的測(cè)定: 索式抽提法[S].

[9] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB/T 5009.3—2010 食品中水分的測(cè)定[S].

[10] 李向紅, 周小玲, 劉永樂(lè), 等. 正交試驗(yàn)優(yōu)化谷氨酰胺酶改性米谷蛋白工藝[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(4): 47-50.

[11] GULEWICZ P, MARTINEZ-VILLALUENGA C, FRIAS J, et al. Effect of germination on the protein fraction composition of different lupin seeds[J]. Food Chemistry, 2008, 107: 830-844.

[12] FAO/WHO. Protein quality evaluation[C]// FAO food and nutrition paper No.51, Rome, 1991.

[13] REEMA, HIRA C K, SADANA B. Nutritional evaluation of supplementary foods prepared from germinated cereals and legumes[J]. Journal of Food Science and Technology, 2004, 41(6): 627-629.

[14] KATSUBE-TANAKA T, DULDULAO J B A, KIMURA Y, et al. The two subfamilies of rice glutelin differ in both primary and higher-order structures[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1699(1): 95-102.

[15] van der BORGHT A, VANDEPUTTE G E, DERYCKE V, et al. Extractability and chromatographic separation of rice endosperm proteins[J]. Journal of Cereal Science, 2006, 44(1): 68-74.

[16] 閆清平, 朱永義. 大米淀粉、蛋白質(zhì)與其食用品質(zhì)關(guān)系[J]. 糧食與油脂, 2001(5): 29-32.

[17] 李里特. 烘焙食品與飲食文化[J]. 食品科技, 2002, 27(4): 28-30.

[18] 何熙璞, 張敏, 李俊芳. γ-氨基丁酸的生理學(xué)功能及研究現(xiàn)狀[J]. 廣西大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2007, 9(增刊1): 465-466.

[19] 茅原, 杉浦友美. 近年のGABA生理機(jī)能研究(腦機(jī)能改善作用、高血壓作用を中心に)[J]. 食品と開(kāi)發(fā), 2001, 36(6): 4-6.

[20] MUBARAK A E. Nutritional composition and anti-nutritional factors of mung bean seeds (Phaseolus aureus) as affected by some home traditional processes[J]. Food Chemistry, 2005, 89(4): 489-495.

Changes in Protein and Amino Acids in Polished Rice with Intact Germ during Germination

LI Xianghong, LIU Yongle*, YU Jian, WANG Faxiang, WANG Jianhui, WANG Mansheng
(Hunan Provincial Engineering Technology Research Center of Aquatic Food Resources Processing, Department of Food and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

Changes in protein and amino acids in polished rice with intact germ during germination were investigated. The results showed that the starch content of polished rice with intact germ left intact decreased, while the protein content increased slightly during germination. SDS-PAGE and SEC-HPLC analysis demonstrated that the subunit compositions of polished rice were not affected signifi cantly by germination, but the subunit contents were changed. The fractions of high molecular weight decreased, and correspondingly, the contents of subunits with low molecular weight increased. The results of amino acid analysis showed that the contents of total amino acids and essential amino acids increased during germination, and the essential amino acid pattern became more reasonable, suggesting that germination can improve the eating quality and nutritional value of polished rice with intact germ.

polished rice with intact germ; germination; rice gluten; amino acid analysis

TS213.3

A

1002-6630（2015）01-0037-04

10.7506/spkx1002-6630-201501007

2014-02-16

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD31B08）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101214；31201427）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JJ4054；12JJ6028）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目（14B009）

李向紅（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品深加工與蛋白質(zhì)工程。E-mail：xianghongl@163.com

*通信作者：劉永樂(lè)（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與大宗農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。E-mail：lyle19@163.com