鄧少穎，王道營，張牧焓，卞 歡，吳海虹，諸永志，耿志明，劉 芳，徐為民,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

鴨胸肌肉加熱過程中肌動(dòng)球蛋白解離研究

鄧少穎1,2，王道營2，張牧焓2，卞 歡2，吳海虹2，諸永志2，耿志明2，劉 芳2，徐為民2,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

為了解鴨胸肌肉加熱過程中肌動(dòng)球蛋白變化情況，本實(shí)驗(yàn)以鴨胸肉為材料，研究了加熱溫度（45、50、55、60、65、70 ℃）和加熱時(shí)間（0、1、10、20、30、60 min）對(duì)肉中肌動(dòng)球蛋白解離的影響。采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)測(cè)定肌動(dòng)蛋白的含量。結(jié)果表明：在45 ℃加熱條件下，肌動(dòng)球蛋白幾乎未發(fā)生解離（P＞0.05）；而在50、55 ℃或60 ℃加熱條件下，隨著加熱時(shí)間的延長，肌動(dòng)蛋白含量先增加后降低，但均較對(duì)照組顯著性增加（P＜0.05）；65 ℃加熱60 min，肌動(dòng)蛋白含量降至對(duì)照組水平；70 ℃加熱條件下，加熱時(shí)間為30 min或60 min，檢測(cè)不到肌動(dòng)蛋白的存在。因此，加熱溫度為50～60 ℃，加熱時(shí)間為10～30 min時(shí)能顯著促進(jìn)肌動(dòng)球蛋白解離。

鴨胸肉；肌動(dòng)蛋白；加熱

對(duì)于肉及其制品，人們大多從色、香、味、嫩等幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中嫩度作為評(píng)判指標(biāo)越來越被更多的消費(fèi)者所關(guān)注[1-2]，對(duì)肉嫩度變化機(jī)理以及影響肉嫩度變化因素的研究逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)問題。熱處理是一種常見的食品加工方式。加熱不僅能夠殺滅細(xì)菌、改善風(fēng)味、熟化食物[3]，而且在一定加熱條件下，肉的嫩度可以得到很大的改善。

宰后僵直期間，嫩度降低，在隨后的解僵成熟過程中，嫩度逐漸得到改善。有研究者觀察動(dòng)物宰后成熟肉肌纖維的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：隨著肉的成熟，肌節(jié)長度較僵直期間增長[4]。目前，普遍認(rèn)為肌原纖維緊密結(jié)構(gòu)弱化是肉品嫩度改善的主要原因[5-8]。肌原纖維是由可調(diào)節(jié)的粗肌絲和細(xì)肌絲組成，粗肌絲主要是由肌球蛋白組成，細(xì)肌絲主要是由肌動(dòng)蛋白組成，并結(jié)合有原肌球蛋白和肌鈣蛋白[9]。Takahashi等[10]研究指出：成熟過程中肌節(jié)長度的增加是由于肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白結(jié)合狀態(tài)以及結(jié)合程度的改變，進(jìn)而弱化了肌原纖維的緊密結(jié)構(gòu)。有研究者在研究雞肉、兔肉、豬肉、牛肉時(shí)發(fā)現(xiàn)：將肉在60 ℃或65 ℃水浴中保留較長時(shí)間，肉的剪切力存在下降趨勢(shì)，即表明低溫長時(shí)間加熱有助于肉嫩度的改善[11-14]。Okitani等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在較低溫度且相對(duì)較長時(shí)間加熱條件下，肌動(dòng)球蛋白存在明顯的解離現(xiàn)象，即觀察到肌動(dòng)蛋白含量的增加，且嫩度較好。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)加熱條件對(duì)肌動(dòng)球蛋白的解離規(guī)律進(jìn)行研究，為提高肉的嫩度、改善肉的品質(zhì)提供新的研究思路及理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉用麻鴨，購自南京孝陵衛(wèi)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，隨機(jī)選取60 日齡左右、大小相近的健康肉用麻鴨，按工業(yè)要求宰殺前禁食、禁水。隨后宰殺、放血、去毛，并迅速取出鴨胸肉，按相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)要求做處理。

抗兔骨骼肌肌動(dòng)蛋白多克隆抗體、羊抗兔IgG、三羥甲基氨基甲烷（Tris，超純級(jí)） 美國Sigma公司；DAB顯色試劑盒 巴傲得生物科技公司；預(yù)染寬范圍標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子質(zhì)量大小范圍14.4～116 ku） 加拿大Fermentas公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M124A電子分析天平 意大利Bel Engineering Srl Bel公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；伯樂Mini-PROTEAN?Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng)、Semi-Dry轉(zhuǎn)印儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 肉樣處理

將選取的麻鴨按企業(yè)工藝宰殺后，迅速取出胸大肌，置于4 ℃冰箱中成熟12 h后，去除肌膜、結(jié)締組織、脂肪后切碎成肉糜狀，待用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

每份準(zhǔn)確稱取2 g經(jīng)1.3.1節(jié)處理過的鴨胸肉樣品，置于5號(hào)蒸煮袋中。用玻璃棒擠壓肉糜使之成為厚1 mm左右的薄片。實(shí)驗(yàn)共設(shè)45、50、55、60、65、70 ℃ 6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組又設(shè)置0（對(duì)照組）、1、10、20、30、60 min 6 個(gè)不同的加熱時(shí)間。將處理好的肉糜薄片置于對(duì)應(yīng)的恒溫水浴鍋中按上述6 組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加熱到所需時(shí)間后，置于冰浴中冷卻至4 ℃左右。每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

上周（8月13日-8月17日），出口市場(chǎng)預(yù)收訂單充裕，價(jià)格高位企穩(wěn)，局部漲跌互現(xiàn)。8月20日中國磷酸二銨批發(fā)價(jià)格指數(shù)（CPPI）為 2847.73點(diǎn)，環(huán)比下跌2.66點(diǎn)，跌幅為0.09%；同比上漲221.74點(diǎn)，漲幅為8.44%；比基期下跌374.04點(diǎn)，跌幅為11.61%。

1.3.3 肌動(dòng)蛋白提取方法

依據(jù)Okitani等[16]的方法，將1.3.2節(jié)經(jīng)過加熱處理并冷卻后的肉糜樣品置于20 mL預(yù)冷的 Weber-Edsall溶液（0.6 mol/L KCl，0.01 mol/L Na2CO3，0.04 mol/L NaHCO3，pH 7.2）中，于冰浴中15 000 r/min勻漿3 次（每次30 s，間隔30 s）。將勻漿液置于4 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中提取24 h后，加入40 mL蒸餾水稀釋，使KCl的終濃度為0.2 mol/L，搖床振蕩60 min后將溶液進(jìn)行離心分離，離心條件為：4 ℃，15 000×g，20 min。取上清液制備電泳樣品。

1.3.4 肌動(dòng)蛋白檢測(cè)方法

依據(jù)Okitani等[15-16]的方法，通過測(cè)定肌動(dòng)蛋白含量的變化來反映肌動(dòng)球蛋白的解離程度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），12%分離膠，5%濃縮膠（m（丙烯酰胺）∶m（甲叉雙丙烯酰胺）=36.5∶1），每孔等體積上樣20 μL，200 V恒壓跑約70 min。電泳結(jié)束后，將分離膠中所需蛋白條帶切割下來并在轉(zhuǎn)膜液中浸泡約15 min后，轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。轉(zhuǎn)印后的PVDF膜在TBST溶液（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，0.05%吐溫-20，pH 7.4）中漂洗5 次，每次5 min。然后將帶有蛋白的PVDF膜在含有5 g/100 mL脫脂奶粉的TBST溶液中室溫孵育2 h。在TBST溶液漂洗3 次后，再將PVDF膜與一抗（一抗是抗兔骨骼肌肌動(dòng)蛋白多克隆抗體，TBST溶液1∶1 000稀釋）結(jié)合，4 ℃孵育12 h，然后膜用TBST溶液再次漂洗3 次后與二抗（二抗是辣根過氧化酶連接的羊抗兔IgG，TBST溶液1∶5 000稀釋）結(jié)合，室溫孵育2 h，TBST溶液漂洗3 次后，用DAB顯色劑對(duì)膜進(jìn)行顯色處理，并使用凝膠成像儀拍照。Quantity One軟件掃描蛋白免疫印跡條帶，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

凝膠成像儀拍照后的圖片（3 個(gè)平行），以Quantity One軟件掃描蛋白免疫印跡條帶，所得的數(shù)據(jù)用SPSS18.0進(jìn)行One-way ANOVA分析和相關(guān)分析，不同處理間 的顯著性差異比較用Duncan’s multiple range tests模型，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 45 ℃水浴條件下加熱時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離程度的影響

圖1 45℃加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響Fig.1 Dissociation of actomyosin in duck meat heated at 45 ℃ for different time durations

2.2 50 ℃水浴加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響

圖2 50℃加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響Fig.2 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 50 ℃ for different time durations

由圖2A可知，在50 ℃水浴中加熱后，隨著加熱時(shí)間的延長，鴨胸肉肉糜中的肌動(dòng)球蛋白發(fā)生了明顯的解離。通過定量分析（圖2B）可知，加熱時(shí)間為10、20、30、60 min的肌動(dòng)蛋白條帶灰度較對(duì)照組均顯著性增加（P＜0.05）；加熱30 min時(shí)，肌動(dòng)蛋白條帶灰度達(dá)到最大值，除與加熱20 min時(shí)無顯著性差異（P＞0.05），與其他處理組相比均有顯著差異。

2.3 55 ℃水浴加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響

圖3 55℃加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響Fig.3 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 55 ℃for different time periods

由圖3A可知，在55 ℃水浴條件下，各個(gè)處理樣的肌動(dòng)蛋白含量均較對(duì)照組明顯增多。隨加熱時(shí)間的延長，肌動(dòng)蛋白含量呈略微下降趨勢(shì)。通過定量分析可知（圖3B），不同處理組的肌動(dòng)蛋白條帶灰度較對(duì)照組均顯著性增加（P＜0.05）；在加熱1～20 min過程中，肌動(dòng)蛋白條帶灰度增加，但增幅并不顯著（P＞0.05），而在加熱30 min后，鴨胸肉肉糜中肌動(dòng)蛋白條帶灰度呈逐漸降低的趨勢(shì)，在加熱30～60 min過程中，肌動(dòng)蛋白條帶灰度沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 60 ℃水浴加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響

圖4 60℃加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響Fig.4 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 60 ℃ for different time periods

由圖4A可知，各個(gè)處理組的肌動(dòng)蛋白含量均較對(duì)照組明顯的增加；隨加熱時(shí)間的延長，肌動(dòng)蛋白含量有降低的趨勢(shì)。通過定量分析（圖4B）可知，加熱1 min時(shí)肌動(dòng)蛋白條帶灰度達(dá)到最大值，與其他處理組均有顯著差異（P＜0.05）；然后隨加熱時(shí)間的延長，肌動(dòng)蛋白含量逐漸降低，加熱時(shí)間為60 min的肌動(dòng)蛋白條帶灰度除與30 min時(shí)相比無顯著性差異外（P＞0.05），與其他組均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.5 65 ℃水浴加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響

圖5 65℃加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響Fig.5 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 65 ℃ for different time periods

由圖5A可知，加熱1 min和10 min時(shí)的肌動(dòng)蛋白含量要明顯高于其他處理組，再隨加熱時(shí)間的延長，肌動(dòng)蛋白條含量逐漸降低。通過定量分析（圖5B）可知，加熱時(shí)間為1 min時(shí)肌動(dòng)球蛋白解離即達(dá)到最大，此時(shí)肌動(dòng)蛋白條帶灰度與其他處理組均有顯著性差異（P＜0.05）；隨加熱時(shí)間的延長，肌動(dòng)蛋白條帶灰度呈梯級(jí)態(tài)逐漸減少，加熱10 min時(shí)的肌動(dòng)蛋白條帶灰度與20 min時(shí)的無顯著差異（P＞0.05）；加熱20 min時(shí)的肌動(dòng)蛋白條帶灰度與30 min無顯著性差異（P＞0.05）；加熱60 min時(shí)，肌動(dòng)蛋白條帶灰度除與對(duì)照組無顯著差異外（P＞0.05），與其他處理組均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.6 70 ℃水浴加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響

圖6 70℃加熱不同時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響Fig.6 Dissociation of actomyosin in duck meat heated 70 ℃ for different time periods

由圖6A可知，在70 ℃水浴中，加熱1 min時(shí)肌動(dòng)蛋白含量最高；隨加熱時(shí)間的延長，肌動(dòng)蛋白含量降低；而當(dāng)加熱時(shí)間延長到30 min和60 min時(shí)，則檢測(cè)不到肌動(dòng)蛋白。通過定量分析（圖6B），加熱時(shí)間為1 min時(shí)的肌動(dòng)蛋白條帶灰度顯著高于其他處理組（P＜0.05）；加熱時(shí)間為10 min和20 min處理組的肌動(dòng)蛋白條帶灰度無顯著性變化（P＞0.05），但與對(duì)照組相比則有顯著差異（P＜0.05）；而加熱時(shí)間為20 min時(shí)的肌動(dòng)蛋白條帶灰度則與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

嫩度是評(píng)價(jià)肉品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，嫩度受到宰前、宰后多種因素的影響，最終表現(xiàn)為肌原纖維及結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)和生化特性對(duì)嫩度的影響[17]。肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白絲是構(gòu)成肌絲的主要蛋白。在活體肌肉中這兩種蛋白是形成肌肉收縮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白結(jié)合形成肌動(dòng)球蛋白。鴨胸肉經(jīng)過排酸成熟后，隨著三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的不斷消耗，大量的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合成肌動(dòng)球蛋白，在宰后成熟過程中，肌動(dòng)球蛋白幾乎沒有發(fā)生解離[14]。加熱是肉品加工常用的方法，在加熱過程中，肉結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生收縮，肌原纖維蛋白受熱變性，使得肌原纖維蛋白間原來的相互作用力發(fā)生變化[18]。有研究表明在終點(diǎn)溫度為70 ℃，與常規(guī)加熱方式相比，梯度加熱有改善嫩度的趨勢(shì)，此過程可能與肌動(dòng)球蛋白的解離有關(guān)[19]。鴨胸肉加熱后，某些蛋白受熱后構(gòu)象首先發(fā)生改變，進(jìn)而原來蛋白質(zhì)分子間的各種作用力以及它們的三維空間構(gòu)象遭到破壞，使得細(xì)胞骨架斷裂，Z盤崩解，加速了肌原纖維蛋白的降解[20]，同時(shí)直接或間接地促進(jìn)肌動(dòng)球蛋白的解離。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鴨胸肉肉糜在45 ℃加熱后，肌動(dòng)球蛋白未發(fā)生顯著性的解離，其可能原因是在該溫度下，肌原纖維的完整結(jié)構(gòu)未遭到破壞，某些相關(guān)性的酶未被激活；而肉糜經(jīng)過50～65 ℃加熱處理后，肌動(dòng)球蛋白大量解離，此結(jié)論與Okitani等[15]研究牛肉、豬肉、雞肉在65 ℃加熱條件下肌動(dòng)球蛋白發(fā)生明顯的解離現(xiàn)象結(jié)論一致，且嫩度較好。而在70 ℃加熱30 min以上，檢測(cè)不到肌動(dòng)蛋白，可能是因?yàn)榧?dòng)蛋白在70～80 ℃結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[21]，而肌動(dòng)球蛋白的最大變性溫度約在80～83 ℃[9,22]，故其可能原因是由于肌動(dòng)球蛋白的熱變性或肌動(dòng)蛋白在較高加熱溫度下溶解度或結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。此外，加熱也可能影響某些酶的活性。Wang Daoying等[23]研究發(fā)現(xiàn)將鴨胸肉加熱到中心溫度為50、60、70 ℃時(shí)鴨胸肉有較好的剪切力，而且檢測(cè)到較高的酶活性，同時(shí)觀察到肌動(dòng)球蛋白發(fā)生了解離，此結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在50～65 ℃觀察到肌動(dòng)球蛋白的解離可能是由鴨肉內(nèi)部環(huán)境共同作用而產(chǎn)生的效果。

4 結(jié) 論

鴨胸肉肉糜在45 ℃加熱條件下，未觀察到肌動(dòng)球蛋白明顯的解離現(xiàn)象；在50～65 ℃加熱條件下，肌動(dòng)蛋白條帶灰度隨加熱時(shí)間的延長先增加后降低，并且隨加熱溫度的升高，加熱相對(duì)較短的時(shí)間即可使肌動(dòng)球蛋白達(dá)到最大的解離效果，在65 ℃加熱條件下長時(shí)間加熱使得肌動(dòng)蛋白條帶灰度降至近似對(duì)照組水平。在70 ℃加熱條件下，加熱時(shí)間延長至30、60 min時(shí)，則檢測(cè)不到肌動(dòng)蛋白的存在。因此，促進(jìn)鴨胸肉中肌動(dòng)球蛋白解離的最佳工藝條件為加熱溫度為50～60 ℃，加熱時(shí)間為10～30 min。在隨后的研究中，可將此條件應(yīng)用到完整的鴨胸肉中，研究肌動(dòng)球蛋白的解離與鴨肉嫩度的相關(guān)性，為提高肉品嫩度研究提供理論基礎(chǔ)。

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Heat-Induced Dissociation of Actomyosin in Duck Breast Muscle

DENG Shaoying1,2, WANG Daoying2, ZHANG Muhan2, BIAN Huan2, WU Haihong2, ZHU Yongzhi2, GENG Zhiming2, LIU Fang2, XU Weimin2,*
(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The present study was performed to illustrate the change of actomyosin in duck breast muscle upon heat treatment. We examined the effects of heating temperature (45, 50, 55, 60, 65 and 70 ℃) and heating time (0, 1, 10, 20, 30 and 60 min) on the dissociation of actomyosin in duck muscle as evaluated by Western blotting on the basis of the change in its content. Results showed no dissociation of actomyosin was observed when muscles were heated at 45 ℃ (P > 0.05). With the extension of heating time, the actin content increased at the early stages and then declined when muscles were heated at 50, 55 or 60 ℃, but it was signifi cantly higher when compared with that in the control group (P < 0.05). After heating at 65 ℃ for 60 min, the actin content decreased to a level identical to that in the control group; however, after heating at 70 ℃ for 30 or 60 min, the presence of actin was not detected. The results suggested that the dissociation of actomyosin was signifi cantly improved when the muscle was heated at a temperature of 50–60 ℃ for 10–30 min.

duck breast; actin; heating

TS251.68

A

1002-6630（2015）01-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201501001

2014-03-06

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101312）

鄧少穎（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄焚|(zhì)量與安全。E-mail：shaoyinglucky@163.com

*通信作者：徐為民（1969—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槿馄芳庸づc質(zhì)量控制。E-mail：weiminxu2002@aliyun.com