李曉青 （河北省任丘市畜牧水產(chǎn)局 062550）

馬立克氏病病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展

李曉青 （河北省任丘市畜牧水產(chǎn)局 062550）

馬立克氏病(Marek′s disease, MD)是由雞的馬立克氏病病毒(Marek′s disease virus, MDV)引起的雞的一種腫瘤性疾病，以淋巴細(xì)胞增生和腫瘤的形成為主要特征，以外周神經(jīng)、生殖腺、臟器、免疫器官中單核細(xì)胞浸潤以及由于外周神經(jīng)腫瘤細(xì)胞的集聚而引起的半癱瘓或完全癱瘓為典型特征。匈牙利著名的獸醫(yī)病理學(xué)家馬立克在1907年首先報(bào)道了該病，英國科學(xué)家Biggs在1961年倡導(dǎo)開始使用馬立克氏病這一名稱[1]。上世紀(jì)二、三十年代，隨著商品雞的死亡數(shù)目的明顯增加，人們開始逐步關(guān)注馬立克氏病。1967年，Churchill等首次報(bào)道從接種病雞細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離到了皰疹病毒[2]。1970年，Calnek等發(fā)現(xiàn)MDV可以以一種具有感染性的游離細(xì)胞形式從羽毛囊排出[3]，由于馬立克氏病毒在雞舍環(huán)境中能夠相對(duì)穩(wěn)定存在，易感雞呼吸系統(tǒng)接觸到空氣中帶有病毒的灰塵或羽屑，都可以引起MD的自然傳播。

直到上世紀(jì)80年代，對(duì)MD腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞特性，腫瘤誘導(dǎo)的成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系的建立，疾病的溶細(xì)胞期和免疫抑制期的確定等研究取得了重大的科研成果。CVI988與SB-1等疫苗株的分離鑒定以及廣泛使用，更使得MD成為第一個(gè)可以用疫苗免疫的腫瘤性疾病。隨著MDV不斷的遺傳變異，毒力不斷的增強(qiáng)，越來越多的疫苗也隨之被研制應(yīng)用。近年來發(fā)現(xiàn)在MDV的疫苗免疫后仍有很高腫瘤發(fā)病率的雞群中，依然能分離到MDV，并且大多數(shù)病例是MDV和REV的共感染，即在腫瘤病雞同時(shí)存在著這兩種病毒的病毒血癥[4]。同時(shí)大量的試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)MDV和REV以及其它反轉(zhuǎn)錄病毒可以進(jìn)行病毒的基因重組。2000年以來，隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)MDV的研究更是突飛猛進(jìn)，目前已繪制出了MDV強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)株GA株的全基因組結(jié)構(gòu)圖[5]。Schumacher、Reddy分別構(gòu)建了含有MDV全基因組的感染性克隆，對(duì)進(jìn)一步研究MDV基因功能以及全基因組測(cè)序提供了更可靠的途徑。

1. MDV基因組結(jié)構(gòu)

通過全基因組測(cè)序證實(shí)，三種血清型的MDV基因組相似，由線性的雙股DNA組成，長(zhǎng)約175kb，分別由末端長(zhǎng)重復(fù)序列(TRL)、長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)(UL)、內(nèi)部長(zhǎng)重復(fù)序列(IRL)、內(nèi)部短重復(fù)序列(IRS)、短獨(dú)特區(qū)(US)和末端短重復(fù)序列(TRS)組成，其中TRL、IRL、IRS、TRS為倒置重復(fù)序列。MDV基因組結(jié)構(gòu)模式為TRL-UL-IRL-IRS-USTRS見圖1。

2000年，Lee等首次繪制了I型MDV GA株的全基因組圖譜(圖2)，為今后MDV全基因組分析提供了可參考的依據(jù)。通過比較超強(qiáng)毒Md5與GA株基因組，發(fā)現(xiàn)I型MDV結(jié)構(gòu)差異很小，GA的基因組比Md5稍微小一點(diǎn)，主要是由于Md5基因組中的TRL和IRL區(qū)域內(nèi)直接重復(fù)序列拷貝數(shù)的增加以及IRS和TRS區(qū)域長(zhǎng)度的增加。

圖2 I型MDV GA株的全基因組結(jié)構(gòu)圖

2 MDV結(jié)構(gòu)蛋白及相關(guān)基因

I型MDV編碼一百多個(gè)蛋白質(zhì)，雖然已經(jīng)對(duì)MDV基因組上的70～80個(gè)特異的基因或區(qū)域的生物學(xué)功能進(jìn)行相關(guān)研究，但至今通過對(duì)MDV感染細(xì)胞的提取物進(jìn)行免疫沉淀試驗(yàn)得到鑒定僅有46個(gè)MDV特異性的多肽[6]。其中僅有為數(shù)不多的幾個(gè)基因在MDV抗原和功能上是有重要作用的。因此將MDV基因根據(jù)在抗原和功能上的作用分為三大類即：（1）與致腫瘤相關(guān)基因：meq、pp38/pp24、v-IL8、和1.8Kb基因家族等[7]；（2）糖蛋白基因：gB、gC、gD、gE、gM、gI、gK、gL；（3）其它基因。

2.1 與致腫瘤相關(guān)基因 （1）meq：I型MDV的基因組中含有兩個(gè)拷貝的meq基因，meq基因由339個(gè)氨基酸組成，在其N末端含有一個(gè)與jun/fos致癌基因家族相似的亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域，而在C末端富含與WT-1腫瘤抑制基因相似的脯氨酸的重復(fù)區(qū)域[8]。Meq蛋白在淋巴瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞核中恒有表達(dá)[9]，在S期的細(xì)胞漿中也有表達(dá)。Meq蛋白在大鼠細(xì)胞中過量表達(dá)可以引起大鼠細(xì)胞凋亡抑制[10]，并且與細(xì)胞調(diào)控因子CDK2的相互作用[11,36]，證實(shí)meq基因與MDV致腫瘤性密切相關(guān)。與致病型的I型MDV不同，MDV疫苗CVI988/Rispens中有一段178bp的插入序列，導(dǎo)致C末端編碼富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的閱讀框架發(fā)生移位[12]。大量的試驗(yàn)都已證實(shí)MDV基因組中的meq基因與其致瘤作用密切相關(guān)[13]。Reddy等人利用粘粒作為載體，構(gòu)建了Md5株的感染性克隆[14]，Lupiani等人在此基礎(chǔ)上利用同源重組的方法敲除掉Md5感染性克隆中的兩個(gè)meq基因，構(gòu)建的重組病毒完全喪失了原始毒株的致腫瘤作用[15]，而且敲除了meq基因的重組病毒rMd5?meq可以作為疫苗有效的預(yù)防超強(qiáng)毒甚至特超強(qiáng)毒的攻擊[16]。（2）pp38/pp24：MDV磷酸化蛋白復(fù)合物，通常稱之為pp38/pp24，由位于TRL和UL區(qū)域的pp24基因和位于IRL和UL區(qū)域的pp38基因編碼[17]，是MD腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞系中唯一能檢出的的一種MDV特異性抗原[18]。試驗(yàn)表明，pp38基因能夠引起雞的免疫抑制[19]，在MDV感染的早期就能檢測(cè)到其表達(dá)[20]。Reddy研究表明，pp38基因?qū)DV的復(fù)制有非常重要的作用，但是并不影響腫瘤的形成[21]。研究表明pp38/pp24對(duì)其上游的雙向啟動(dòng)子的活性有調(diào)控作用[22]，可以調(diào)控pp38/pp24和1.8kb基因家族的轉(zhuǎn)錄。（3）v-IL8：致腫瘤毒株(RB1B、Md5)的vIL-8基因的缺失證實(shí)vIL-8并不影響MDV的轉(zhuǎn)化和潛伏期，但是與早期的裂解性復(fù)制和靶細(xì)胞的吸引有關(guān)[23]。v-IL8基因缺失突變株能顯著降低感染雞的腫瘤率[24]。（4）1.8kb基因家族：幾個(gè)極早期轉(zhuǎn)錄子起源于1.8kb基因家族(又稱1.8kb mRNA)。1.8kb mRNA包含3個(gè)外顯子，位于MDV基因組的UL和IRL連接區(qū)。雖然1.8kb基因家族能轉(zhuǎn)錄不同的mRNA，但是僅在MDV強(qiáng)毒株中表現(xiàn)出很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性。1.8kb mRNA對(duì)其上游雙向啟動(dòng)子活性具有增強(qiáng)作用，其開放閱讀框A和C對(duì)雞的致瘤性有一定的影響。1.8kb mRNA轉(zhuǎn)錄方向與pp38基因相反，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于相對(duì)pp38起始位點(diǎn)的-670到-680處[25]。試驗(yàn)研究證實(shí)，隨著MDV的連續(xù)傳代，其基因組中的132bp串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)增加，導(dǎo)致1.8kb mRNA基因家族會(huì)發(fā)生擴(kuò)增。隨著MDV的連續(xù)傳代，導(dǎo)致1.8kb mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物丟失，病毒致病性也會(huì)逐漸減弱。由于具有致瘤性的MDV強(qiáng)毒株中只有2～3個(gè)拷貝的132bp重復(fù)序列，而在非致瘤毒株中這一132bp重復(fù)序列的拷貝數(shù)不等[26]，同時(shí)敲除掉致病性MDV 基因組中2個(gè)拷貝的132bp串聯(lián)重復(fù)序列后，其致腫瘤性以及MDV早期的復(fù)制能力均沒有變化，連續(xù)傳代后，MDV毒力也能夠致弱，這說明病毒的致弱機(jī)制與132bp串聯(lián)重復(fù)序列是無關(guān)的[27]，也進(jìn)一步表明1.8kb基因家族的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者它們編碼的蛋白質(zhì)與MDV的致瘤性密切相關(guān)。

2.2 糖蛋白基因 MDV的糖蛋白B是一種重要的MDV中和性抗原，能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生中和抗體，與保護(hù)性免疫應(yīng)答相關(guān)，對(duì)于細(xì)胞吸附和MDV進(jìn)入很重要。糖蛋白B不具有分泌特性，僅存在于細(xì)胞的胞漿中。（1）gB基因：MDV的糖蛋白B是一種重要的MDV中和性抗原，能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生中和抗體，與保護(hù)性免疫應(yīng)答相關(guān)，對(duì)于細(xì)胞吸附和MDV進(jìn)入很重要。糖蛋白B不具有分泌特性，僅存在于細(xì)胞的胞漿中。（2）gC基因：MDV糖蛋白gC由UL44編碼，同時(shí)被稱為MDV的“A抗原”[28]。雖然糖蛋白gC也涉及到細(xì)胞對(duì)病毒的吸附，但是其同時(shí)具有干擾其他糖蛋白的功能。MDV在CEF細(xì)胞上經(jīng)過連續(xù)的傳代培養(yǎng)，病毒毒力減弱，糖蛋白C的表達(dá)水平明顯降低。盡管糖蛋白gC的表達(dá)和毒力有明顯的聯(lián)系，但是在某些弱毒中糖蛋白gC的表達(dá)量卻維持在一個(gè)較高的水平，因此至今沒有證實(shí)gC涉及到MDV的毒力[29]。（3）gD基因：gD是由US6編碼的，對(duì)于它的功能至今不明確。試驗(yàn)研究表明gD在體外不能很好的表達(dá)甚至完全不表達(dá)。（4）gE、gI、gK、gL、gM：試驗(yàn)證實(shí)gEgI復(fù)合物和gMUL49.5復(fù)合物對(duì)于MDV的排出有關(guān)。如果缺失MDV基因組中的gE或gI基因，重組病毒不能夠在雞的成纖維細(xì)胞間傳播，不再形成MDV特有的細(xì)胞病變。因此gE基因和gI基因是MDV在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳播所必需的。2.3 其它基因 近年來，隨著各種生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的MDV基因功能被人們所認(rèn)識(shí)，但是還有一些基因的功能不能確定，只是根據(jù)其它皰疹病毒的同源物推斷得出。如：UL36、UL45、UL46、UL47、UL48、UL49、及US1、US2、US10等衣殼蛋白類基因；UL12、UL13、UL23、UL30等具有調(diào)控活性或者酶活性的蛋白質(zhì)基因。

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