牛冬梅，周萬青，洪 駿，陳 云

氨基糖苷類抗生素作為一類高效、廣譜的抗生素，由于該類抗菌藥物的過度使用，使得臨床分離株的耐藥率呈逐年上升趨勢［1］。細菌對該類藥物耐藥主要通過產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶、16S rRNA甲基化酶以及整合子攜帶相關(guān)基因等途徑［2-4］。氨基糖苷類藥物中抗菌譜較寬的阿米卡星(AMK)在臨床上應用較為廣泛。然而在K-B紙片擴散法藥敏檢測試驗中，革蘭陰性桿菌對AMK耐藥表型可表現(xiàn)為單純的耐藥表型和誘導耐藥表型［5］。對于導致AMK雙圈(double zone，DZ)耐藥的鮑曼不動桿菌相關(guān)耐藥機制研究已有報道［5-7］，也進行了一些探討［8-9］。目前一些自動化的微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)已得到了廣泛應用，應用較為廣泛的自動化鑒定及藥敏系統(tǒng)主要有Vitek、Phoenix和MicroScan三種。為評估以上藥敏系統(tǒng)對在K-B紙片擴散法中對AMK呈雙圈耐藥的腸桿菌科細菌藥敏試驗情況及相關(guān)耐藥機制，我們進行了以下試驗。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2011年11月-2013年09月間從南京鼓樓醫(yī)院分離的K-B紙片擴散法對AMK呈雙圈耐藥的大腸埃希菌 8株(編號 Eco35、Eco85、Eco110、Eco122、Eco126、Eco174、Eco235、Eco290)、肺炎克雷伯菌4株(編號 Kpn94、Kpn110、Kpn113、Kpn201)和產(chǎn)氣腸桿菌1株(E112)，分別分離自尿液6例，分泌物4例、膽汁2例和引流液1例。同期分離的AMK完全耐藥和敏感的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌各兩株作為對照菌株。菌株經(jīng)Vitek 2 Compact鑒定卡(法國梅里埃公司產(chǎn)品)鑒定。ATCC Escherichia coli 25922、ATCC Pseudomonas aeruginosa 27853作為質(zhì)控菌株，

1.2 儀器及試劑 Taq DNA聚合酶、10×buffer(含Mg2+)、dNTPs(TaKaRa公司);DNA marker(美國Ferments公司);AMK藥敏紙片(英國Oxoid公司)、AMK粉劑(中國藥品生物制品檢定所);Vitek 2 Compact及配套AST-GN13藥敏卡(法國生物梅里埃公司);Phoenix-100及配套NMIC/ID4藥敏卡(美國BD公司);MicroScan AS-4及配套藥敏NC50卡(西門子公司);蛋白酶K(德國Merck公司);PCR擴增儀(美國PE公司);生物電泳圖像分析系統(tǒng)及Smart View分析軟件(上海復日公司)。

1.3 藥敏試驗 自動化藥敏系統(tǒng)試驗:分別按Vitek 2 Compact、Phoenix和MicroScan儀器操作要求及配套的藥敏卡檢測最低抑菌濃度(MIC);K-B紙片擴散法及瓊脂稀釋法操作參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2013年標準。MIC結(jié)果判斷依據(jù)CLSI規(guī)定的腸桿菌科細菌AMK藥敏折點:MIC≥64 mg/L為耐藥(R)、32 mg/L為中介(I)、≤16 mg/L為敏感(S)。

1.4 細菌DNA提取 挑取純培養(yǎng)菌落置于0.5 mL離心管內(nèi)(內(nèi)預置200 ng/mL蛋白酶K溶液200 μL)，56 ℃水浴2 h，改 95 ℃水浴10 min，13 000 g離心30 s。上清液即為基因檢測的模板液，置－20℃冰箱備用。

1.5 耐藥相關(guān)基因PCR擴增 參照文獻［2-4］分別合成氨基糖苷類修飾酶基因、Ⅰ～Ⅲ類整合酶基因及整合子可變區(qū)以及16S rRNA甲基化酶基因擴增引物，序列見表1，由上海英駿公司合成?？偡磻w系為50 μL，其中10 × buffer(含 Mg2+)5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)各 4 μL，DNA 模板 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 2 μL，Taq DNA 酶 0.3 μL，ddH2O 34.7 μL。PCR反應條件:預變性94℃ 5 min;94℃30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共 30 個循環(huán);最后延伸72℃ 7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察。將PCR擴增陽性產(chǎn)物送上海美吉公司測序，結(jié)果在Genbank上比對。

表1 靶基因PCR引物序列及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果 13株雙圈表型腸桿菌科細菌對常規(guī)藥物呈現(xiàn)出多重耐藥性，僅對亞胺培南、厄他培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢替坦較為敏感，敏感率在75%以上，對其他檢測藥物的耐藥率均在50%以上。藥敏結(jié)果見表2。K-B紙片擴散法藥敏試驗顯示所測13株菌株對AMK均呈現(xiàn)雙圈耐藥表型;瓊脂稀釋法結(jié)果顯示，13株雙圈表型菌株與4株完全耐藥對照菌株對 AMK均耐藥，MIC值均 ＞512 mg/L，4株敏感菌株對AMK均敏感，MIC值均≤2 mg/L。見表3。

三種自動化藥敏系統(tǒng)對于敏感及完全耐藥菌株的藥物敏感性結(jié)果與K-B紙片擴散法相符。而對于雙圈表型菌株，Phoenix和MicroScan藥敏系統(tǒng)結(jié)果均為耐藥;而Vitek 2 Compact藥敏卡出現(xiàn)不同結(jié)果，其中4株菌株為敏感，4株為中介，5株為耐藥。見表3。

2.2 PCR檢測結(jié)果 13株雙圈菌株和8株對照菌株中17株菌株檢出不同的氨基糖苷類修飾酶基因，其中單獨攜帶 aac(6’)-Ⅰ基因 10株;Eco126、Kpn94和 Eco1113 同 時 檢 出 aac(6’)-Ⅰ和 ant(2")-I基因;Eco174和Kpn201同時檢出aac(3)-Ⅱ和aac(6’)-Ⅰ;Kpn110 檢出 ant(3")-Ⅰ基因;E112 檢出aac(3)-Ⅱ基因;其余4株菌株均未檢出以上6種氨基糖苷類修飾酶基因。

表2 13株對AMK雙圈耐藥的腸桿菌科細菌對17種抗菌藥物的耐藥性(株)

表3 雙圈耐藥和對照菌株藥敏結(jié)果及相關(guān)基因檢測結(jié)果

13株雙圈菌株和8株對照菌株中18株擴增出Ⅰ類整合酶基因，其中15株攜帶可變區(qū)基因盒。攜帶基因盒為aadA5-dfra17(1.6 kb)菌株8株，攜帶基因盒為aadA2-dfrA12(1.8 kb)3株，攜帶基因盒dfrA12-orfF-aadA2(2.0 kb)2株，未檢出Ⅱ類、Ⅲ類整合酶基因。13株雙圈耐藥表型菌株均擴增出armA甲基化酶基因，測序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)基因突變，未檢出rmtB基因;而8株對照菌株均未擴增出armA、rmtB基因。結(jié)果見表3。

3 討論

雙圈耐藥表型菌株和完全耐藥、敏感對照菌株大多檢出1種以上氨基糖苷類修飾酶基因，其中aac(6’)-Ⅰ和aac(3)-Ⅱ基因的檢出率較高，這與國內(nèi)的調(diào)查大體一致［10］。aac(6’)-Ⅰ基因是腸桿菌科細菌對氨基糖苷類藥物耐藥的重要修飾酶基因，可修飾妥布霉素、奈替米星、卡那霉素和阿米卡星。aac(3)-Ⅱ可使細菌對妥布霉素、奈替米星及慶大霉素耐藥。本實驗中4株AMK敏感細菌均檢出aac(6’)-Ⅰ基因，但菌株卻對AMK敏感，這可能與菌株耐藥基因表達量少致體外表型試驗尚不能檢測出有關(guān)［11］。研究顯示，由于氨基糖苷類修飾酶基因的多樣性，雖然耐藥菌株攜帶不同的氨基糖苷類修飾酶基因，但卻與耐藥表型不具一致性，這可能與氨基糖苷類藥物耐藥的其他相關(guān)機制有關(guān)［12］。

整合子是一系列遺傳元件構(gòu)成的能夠識別和捕獲移動性基因盒的位點特異性重組系統(tǒng)，是細菌尤其是革蘭陰性菌多重耐藥迅速傳播的重要原因［13］。13株雙圈耐藥菌株和8株對照菌株中18株擴增出Ⅰ類整合酶基因，其中15株攜帶基因盒?？勺儏^(qū)攜帶基因盒分別為 aadA5-dfra17、aadA2-dfrA12和dfrA12-orfF-aadA2三種。dfrA12和dfrA17造成菌株對甲氧芐啶耐藥，而aadA2和aadA5則造成菌株對鏈霉素和壯觀霉素耐藥，并不造成對AMK耐藥［4］。另據(jù)張躍進等［14］對肺炎克雷伯菌中攜帶的整合子基因盒調(diào)查發(fā)現(xiàn)，aadA5-dfrA17基因盒最為多見。

16S rRNA甲基化酶可造成菌株對氨基糖苷類藥物的高水平耐藥(＞512 mg/L)，而armA基因則是最常見的一種甲基化酶［3］。本文雙圈耐藥菌株均檢出armA基因，而完全耐藥菌株和敏感菌株均未檢出。由此推測，AMK雙圈耐藥表型的出現(xiàn)與16S rRNA甲基化酶armA基因的表達相關(guān)。Jung等 研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌AMK DZ耐藥表型與armA基因表達相關(guān)，同時外排機制也發(fā)揮著重要作用。在腸桿菌科細菌AMK DZ耐藥表型中是否與外排機制相關(guān)尚待進一步研究。

對于雙圈耐藥表型，用自動化藥敏系統(tǒng)檢測結(jié)果會產(chǎn)生一定的偏倚［7-8］。我們所檢測的13株K-B紙片擴散法對AMK呈DZ耐藥表型的腸桿菌科細菌中，瓊脂稀釋法結(jié)果均為耐藥;三種自動化藥敏系統(tǒng)中的Phoenix和MicroScan兩種系統(tǒng)均為耐藥，而Vitek 2 Compact鑒定系統(tǒng)結(jié)果4株菌株為敏感，4株為中介，5株為耐藥。Vitek 2 Compact藥敏卡ASTGN-13的使用說明中指出其使用限制:鮑曼不動桿菌對AMK的MIC值為8或16mg/L時，需用其他藥敏方法確認，尤其對于多重耐藥的鮑曼不動桿菌［15-16］，而對腸桿菌科細菌并未有特別說明。對于氨基糖苷類藥物在自動化藥敏系統(tǒng)中檢測的準確性也有文獻報道［7，15-16］。在檢測鮑曼不動桿菌對AMK的敏感性試驗中發(fā)現(xiàn)，自動化儀器出現(xiàn)敏感結(jié)果而紙片擴散法結(jié)果卻為耐藥［12，16］。其中 Phoenix和MicroScan兩種自動化儀器的結(jié)果比Vitek2結(jié)果更加接近于實際的MIC結(jié)果［16］。紙片擴散法和E-test方法在這類藥物敏感性的檢測上具有明顯的優(yōu)越性，而且這種錯誤的產(chǎn)生與是否產(chǎn)特異性氨基糖苷類修飾酶基因不具相關(guān)性［16］。

準確的菌株藥敏試驗對于感染的治療至關(guān)重要，尤其對于目前細菌耐藥性逐漸升高的狀況［17-19］。目前絕大多數(shù)的現(xiàn)代化微生物實驗室很大程度上依賴自動化的微生物鑒定藥敏系統(tǒng)。然而，自動化藥敏系統(tǒng)有時卻產(chǎn)生差錯［12，15-16，20-23］。Vitek 2 Compact自動化微生物系統(tǒng)在檢測腸桿菌科細菌AMK敏感性時可能出現(xiàn)假敏感，避免這種差錯的簡便方法就是用K-B紙片擴散法復檢。

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