陳會英，張久明，韓穎，孫丹丹，崔韶暉，趙軼男，張樹彪

[大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（國家民委-教育部生物資源與技術(shù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），遼寧 大連 116600]

·論著·

CS-g-PEI的均相制備及在基因治療中的應(yīng)用*

陳會英，張久明，韓穎，孫丹丹，崔韶暉，趙軼男，張樹彪

[大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（國家民委-教育部生物資源與技術(shù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），遼寧 大連 116600]

目的采用綠色溶劑離子液體合成不同接枝率的非病毒基因載體殼聚糖接枝聚乙烯亞胺（CS-g-PEI），獲得高效低毒的殼聚糖基非病毒基因治療載體。方法以離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[BMIM] Cl）為反應(yīng)介質(zhì)，羰基二咪唑（CDI）為鍵合試劑，均相合成殼聚糖（CS）接枝聚乙烯亞胺（PEI），得到不同接枝率的殼聚糖接枝聚乙烯亞胺共聚物，采用紅外光譜對接枝共聚物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。在人腦癌細(xì)胞（Hep-2）中采用綠色熒光蛋白（GFP-N2）和MTT法對其基因轉(zhuǎn)染性能和細(xì)胞毒性進(jìn)行體外評價(jià)。結(jié)果離子液體中均相合成的CS-g-PEI具有高的基因轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性。結(jié)論合成的CS-g-PEI是一種高效低毒的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，具有臨床應(yīng)用的潛力。

基因治療；離子液體；殼聚糖；聚乙烯亞胺；接枝共聚

腫瘤已成為目前威脅人類健康和生命的頭號殺手，發(fā)病率隨著各種因素的影響正呈快速上升趨勢[1]?；蛑委熂夹g(shù)是一項(xiàng)生物醫(yī)學(xué)高新技術(shù)，其運(yùn)用于腫瘤治療將為癌癥的臨床治療開拓一個(gè)新的空間[1-3]?；蛑委煹年P(guān)鍵在于開發(fā)安全、高效的基因遞送載體?；蜻f送載體分為病毒和非病毒載體兩

類[4]。病毒載體因在多數(shù)情況下具有較高的轉(zhuǎn)染效率被廣泛研究[5]。但目前研究和應(yīng)用的病毒載體存在許多不足，如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特異性差、制備較復(fù)雜及費(fèi)用較高等，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。非病毒基因載體因免疫原性低、安全性高、容量大和易于批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)愈來愈被重視[6-7]。天然陽離子堿性多糖殼聚糖，是天然多糖甲殼素（chitin）完全或者部分脫乙?；漠a(chǎn)物，具有良好的生物相容性、可降解性、低免疫原性、良好的細(xì)胞黏附能力及跨膜特性等優(yōu)點(diǎn)，正成為非病毒基因載體的熱門研究內(nèi)容之一[8-11]。然而由于殼聚糖自身水溶性較差，與其他陽離子聚合物或者陽離子脂質(zhì)體相比，轉(zhuǎn)運(yùn)核酸進(jìn)入細(xì)胞的效率并沒有優(yōu)勢。為了改進(jìn)和拓寬殼聚糖在基因轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用，研究人員對殼聚糖進(jìn)行了各種修飾改性[12]。但殼聚糖的高結(jié)晶性和難溶性使得許多對其改性修飾的化學(xué)反應(yīng)只能在多相介質(zhì)中進(jìn)行。最近隨著殼聚糖溶解體系的深入研究，均相衍生化和均相接枝化的研究方法不斷出現(xiàn)[13]。

本研究在離子液體[BMIM]Cl為反應(yīng)介質(zhì)均相制備CS-g-PEI的研究工作的基礎(chǔ)上[14-15]，在[BMIM] Cl中制備了不同接枝率的CS-g-PEI非病毒基因載體，并采用GFP-N2質(zhì)粒DNA和MTT法對其基因治療性能進(jìn)行了體外評價(jià)。

1 資料與方法

1.1材料與試劑

殼聚糖（CS，Mw=40 000，脫乙酰度≥85%），國藥試劑，使用前經(jīng)100℃真空干燥8 h，聚乙烯亞胺（PEI，Mw=1 800），純度99%），阿拉丁試劑有限公司，使用前在80℃真空干燥24 h，聚乙烯亞胺（PEI-25，Mw=25 000），純度99%，Sigma試劑有限公司，1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽[BMIM]Cl，按照文獻(xiàn)制備[16]，使用前在80℃真空干燥24 h，羰基二咪唑（CDI），分析純，北京偶聯(lián)試劑有限公司，質(zhì)粒pGFP-N2和pGL3，Promega公司，細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM，Invitrogen公司；熒光素酶檢測試劑盒，Promega公司，人宮頸癌細(xì)胞株Hep-2，上海細(xì)胞庫。其余材料和試劑均為分析純。

1.2儀器設(shè)備

紅外光譜儀（PRESTIGE21，日本），高溫滅菌鍋（Tomy，日本），二氧化碳培養(yǎng)箱（NAPCO6500，法國），多功能酶標(biāo)儀（伯樂680，美國），微光發(fā)光檢測儀（Synergy2，美國），凝膠成像系統(tǒng)（KODAK，美國），倒置熒光顯微鏡（蔡司AZIOVERT-25CFL，美國）。

1.3方法

1.3.1CS-g-PEI的均相合成在反應(yīng)器中加入20 g[BMIM]Cl，置入80℃油浴中加熱熔化。加入0.5 g殼聚糖，在氮?dú)鈿夥障聰嚢?，通過偏光顯微鏡觀察，攪拌至殼聚糖完全溶解。稱取適量的CDI，加入殼聚糖的[BMIM]Cl溶液中，80℃下攪拌反應(yīng)2 h。再加入適量的PEI，80℃反應(yīng)2 h。在反應(yīng)液中加入無水乙醇，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除無水乙醇后回收離子液體，濾餅轉(zhuǎn)移至透析袋中（MWCO=8 000～14 000），去離子水透析3 d，冷凍干燥，得到CS-g-PEI。固定CDI和CS的質(zhì)量比為1，通過改變第2步反應(yīng)中加入的PEI的量，可以控制PEI的接枝率，得到不同接枝率的CS-g-PEI。采用紅外光譜對CS-g-PEI進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.3.2CS-g-PEI載體基因治療效果評價(jià)基因治療轉(zhuǎn)染效率采用GFP-N2質(zhì)粒DNA和pGL3質(zhì)粒DNA為報(bào)告基因，在Hep-2細(xì)胞中進(jìn)行體外評價(jià)。用復(fù)凝聚的方法制備CS-g-PEI/DNA和CS/DNA納米復(fù)合物。以5×104個(gè)/孔的密度將Hep-2細(xì)胞接種到24孔板中，在37℃，5%二氧化碳條件下孵育18～24 h后至細(xì)胞融合度達(dá)到80%。轉(zhuǎn)染前2 h，將完全培養(yǎng)基吸去，用PBS洗滌2次，加入400μl無血清培養(yǎng)基和不同N/P比（質(zhì)量比）的CS-g-PEI/DNA復(fù)合物（每孔含1μg DNA）孵育5 h后，將無血清培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基。48 h后，在倒置熒光顯微鏡上觀測綠色熒光蛋白表達(dá)效果；在酶標(biāo)儀上檢測熒光素酶表達(dá)效果，轉(zhuǎn)染效率表示為RLU/mg蛋白。

1.3.3MTT法評價(jià)細(xì)胞毒性以1×104個(gè)/孔的密度將Hep-2細(xì)胞接種到96孔板中，在37℃，5%二氧化碳條件下孵育24 h后分別加入20μl CS-g-PEI和CS溶液，以相同濃度的PEI-25作為正對照。培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液后，每孔加入150μl DMSO，在37℃繼續(xù)孵育30 min。選擇570 nm波長，在SUNRISE酶標(biāo)儀上測定各孔吸光值，檢測前自動混勻600 s。細(xì)胞活性的表達(dá)結(jié)果為：細(xì)胞存活率（%）=A570（sample）/A570（control）×100，其中A570（sample）為聚合物及其復(fù)合物加入的孔的吸光值，A570（control）為只含培養(yǎng)基的孔的吸光值。

2 結(jié)果

2.1接枝率

按照接枝率計(jì)算公式G=（W1-W0）/W0×100%，得到CS-g-PEI-1，CS-g-PEI-2和CS-g-PEI-3 3個(gè)樣品的接枝率分別為6.7%、13.5%和39.8%。G：接枝率（%），W0：殼聚糖初始質(zhì)量（g），W1：接枝共聚物質(zhì)量（g）。

2.2紅外表征

CS-g-PEI和CS的FTIR譜圖如圖1所示。3 380 cm-1對應(yīng)于CS結(jié)構(gòu)中O-H、N-H的伸縮振動峰，2 860 cm-1附近為C-H的伸縮振動峰，1 650 cm-1對應(yīng)于酰胺鍵中C=O的伸縮振動峰。1 030 cm-1和1 070 cm-1對應(yīng)于醇羥基的C-O伸縮振動吸收峰，而在1 140 cm-1附近為吡喃環(huán)中醚鍵伸縮振動引起的肩峰。與CS相比，CS-g-PEI1、2、3在2 860 cm-1、1 650 cm-1和1 100 cm-1附近的紅外吸收峰強(qiáng)度有明顯增加，分別歸屬于CS-g-PEI中PEI部分C-H伸縮振動、NHCONH中C=O伸縮振動、和C-N伸縮振動的貢獻(xiàn)?？紤]到所用PEI的分子量為1 800，而透析袋的MWCO范圍為8 000～14 000，沒有成功共價(jià)接枝到殼聚糖骨架的PEI經(jīng)透析被分離，因此圖1中歸屬為PEI部分的紅外吸收峰來自于與殼聚糖共價(jià)接枝的PEI部分的貢獻(xiàn)。FTIR譜圖分析結(jié)果表明，PEI與CS發(fā)生了共價(jià)接枝。隨著接枝率的不同，紅外光譜也表現(xiàn)出差異。

圖1 CS和CS-g-PEI的紅外光譜

圖2 GFP-N2質(zhì)粒DNA在Hep-2細(xì)胞中的體外轉(zhuǎn)染效果

圖3 pGL3質(zhì)粒DNA在Hep-2細(xì)胞中的體外轉(zhuǎn)染效果

圖4 CS-g-PEI的MTT細(xì)胞毒性評價(jià)

2.3載體基因治療效果評價(jià)

在Hep-2細(xì)胞中，以GFP-N2質(zhì)粒DNA為報(bào)告基因，評價(jià)CS-g-PEI作為非病毒基因載體進(jìn)行基因治療的體外轉(zhuǎn)染效果，CS-g-PEI和GFP-N2的N/P比為4，轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖2所示。PEI-25是陽離子聚合物非病毒基因載體轉(zhuǎn)染效率評價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究以PEI-25作為正對照（N/P=4）。從圖2可以看出，未進(jìn)行PEI接枝的CS在Hep-2細(xì)胞中的幾乎不表現(xiàn)出體外轉(zhuǎn)染，而不同接枝率CS-g-PEI均表

現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)染效率，而隨著接枝率的增加，轉(zhuǎn)染效率增高，CS-g-PEI-3的轉(zhuǎn)染效率超過PEI-25。以pGL3質(zhì)粒DNA為報(bào)告基因，對CS-g-PEI的基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行定量評價(jià)，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，轉(zhuǎn)染效率隨著N/P的增加而增加，隨著PEI接枝率的增加而增加。當(dāng)N/P比為4時(shí)，當(dāng)接枝率從6.7%增加到13.5%再增加到39.8%時(shí)，轉(zhuǎn)染效率從1.2×105增加到1.7×105再增加到2.9×105，轉(zhuǎn)染效率與接枝率不構(gòu)成嚴(yán)格的正比關(guān)系，而是隨接枝率增加而顯著增加。體外轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，[BMIM]Cl中均相合成的CS-g-PEI有望成為基因治療具有應(yīng)用潛力的殼聚糖基非病毒基因載體。

2.4MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與PEI-25相比，CS-g-PEI均具有較低的細(xì)胞毒性，PEI-25的細(xì)胞存活率僅為22%，致死量達(dá)到78%。而CS-g-PEI的細(xì)胞存活率均在80%以上，細(xì)胞毒性比PEI-25低約4倍。該MTT細(xì)胞毒性評價(jià)結(jié)果進(jìn)一步說明，[BMIM]Cl中合成的CS-g-PEI是一種生物安全的殼聚糖基非病毒基因載體，在基因治療領(lǐng)域具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。見圖4。

3 討論

本研究在離子液體[BMIM]Cl中均相合成了不同接枝率的CS-g-PEI殼聚糖基非病毒基因載體。通過FTIR對不同接枝率的共聚物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。采用MTT法在Hep-2細(xì)胞系中對其基因治療性能進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染評價(jià)；GPF-N2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率評價(jià)結(jié)果表明，接枝率達(dá)到39.8%的CS-g-PEI-3的轉(zhuǎn)染效率超過聚合物轉(zhuǎn)染金標(biāo)準(zhǔn)PEI-25，而MTT毒性評價(jià)結(jié)果表明，CS-g-PEI的細(xì)胞致死量小于20%，其細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于PEI-25。CS-g-PEI有望成為基因治療臨床應(yīng)用極具潛力的殼聚糖基非病毒基因載體。

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（張蕾 編輯）

Homogeneous synthesis of CS-g-PEI and its application in gene therapy*

Hui-ying CHEN,Jiu-ming ZHANG,Ying HAN,Dan-dan SUN, Shao-hui CUI,Yi-nan ZHAO,Shu-biao ZHANG
(Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization,the National Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education,Dalian Nationalities University, Dalian,Liaoning 116600,P.R.China)

【Objective】To graft chitosan with various amount of low molecular weight polyethylenimine (CS-g-PEI)by ionic liquid and obtain a kind of efficient and safe chitosan based non-viral gene vectors.【Methods】CS-g-PEI copolymers with various graft ratios were homogeneously synthesized using ionic liquid 1-butyl-3-methyl imidazolium chloride[(BMIM)Cl]as the reaction solvent and 1,1-carbonyldiimidazole(CDI) as the coupling reagent.The structures were confirmed by FTIR.The transfection performance was evaluated in Hep-2 cell line in vitro.【Results】CS-g-PEI copolymers synthesized by ionic liquid[(BMIM)Cl]improved gene transfection efficiency and had low cytotoxicity.【Conclusion】The synthetic CS-g-PEI copolymers have good potential in gene therapy as non-viral gene vector candidates.

gene therapy;ionic liquid;chitosan;PEI;graft-copolymer

R945；O636.9

A

1005-8982（2015）24-0001-04

2015-03-05

國家863高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（No：2014AA020707）；國家自然科學(xué)基金（No：21176046）；大連民族大學(xué)中央高校自主科研基金；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（No：X201403051）

張樹彪，E-mail：zsb@dlnu.edu.cn，Tel：0411-87656430