張鵬 弓瑞娟

（山西省畜牧遺傳育種中心030027）

甘油稀釋濃度對牛凍精活率的影響

張鵬 弓瑞娟

（山西省畜牧遺傳育種中心030027）

研究不同濃度的甘油對牛精液在冷凍后的活率，觀察到甘油在牛冷凍精液稀釋液的添加濃度為4%時，不但足以保護精子細胞，而且可以在冷凍過程中將損害降到最小，表明4%的甘油濃度對牛精子冷凍的效果最好。

牛精子；甘油濃度；精子活率；精子頂體完整率

近年來我國種公牛站在配制牛冷凍精液的稀釋液時所采用的防凍保護劑大多為甘油，本文通過不同濃度的甘油對牛冷凍精液在冷凍后活率的影響試驗，探討不同濃度甘油對牛精子在冷凍過程中的影響，從而篩選出有利于牛精子冷凍的最佳甘油濃度。

甘油的分子量為92.09，結構簡式為CH2OHCHOHCH2OH，甘油的理化特性具有溶于水不易發(fā)生結晶、吸水性強和可降低水溶液冰點的特點；當牛精液冷凍時，主要受到的危害是冰晶從精細胞原生質中抽去水，使精細胞造成脫水狀態(tài)，發(fā)生不可逆的變化死亡，而甘油可以減少和降低這種對精細胞的損害作用。

1 材料與方法

1.1 牛冷凍精液稀釋液配方

用電子天平準確稱量配制稀釋液所需的藥品，所用藥品為分析純。

配方Ⅰ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、0%甘油

配方Ⅱ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、2%甘油

配方Ⅲ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、3%甘油

配方Ⅳ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、4%甘油

配方Ⅴ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、5%甘油

配方Ⅵ葡萄糖、三羥甲基胺基甲烷、6%甘油

以上6種配方均滅菌后加入相同量的卵黃和相同量的抗菌素。

1.2 試驗方法

選出山西省畜牧遺傳育種中心正常參加采精的荷斯坦種公牛10頭進行采精，采得精液后先對精液進行質檢，各項指標合格且活率均在0.6以上者方可用于本次試驗。將經(jīng)過初步檢測的牛精液分別用以上6種稀釋液并根據(jù)牛精液品質的不同，按照有效精子數(shù)300～500萬/劑進行稀釋后分裝入0.25ml細管。將這些牛精液細管按照不同的甘油濃度分成6組放入4℃恒溫冰箱平衡3～4h后放入全自動冷凍儀進行冷凍。經(jīng)過7min的冷凍后迅速取出放入液氮中保存。將冷凍好的牛精液按照每組每頭牛抽取10支的方法依照標準解凍，要求解凍后進行活率檢測（用細管中1/2的精液量）并記錄結果，同時進行精子頂體完整率的檢測 （用活率檢測后細管中剩余的1/2精液）并記錄結果。

1.3 統(tǒng)計分析

這次試驗采用次級樣本含量相等的系統(tǒng)分組分析方法進行方差分析，并且進行F檢驗。

2 結果

通過分析試驗結果可以得出：不同甘油濃度對牛精液冷凍后活率的影響差異極顯著 （P＞0.01）， 甘油濃度為4%顯著高于5%和6%，極顯著高于0%、2%和3%；5%極顯著高于3%，6%顯著高于3%，5%和6%極顯著高于0%和2%，5%顯著高于6%；3%顯著高于2%，2%和3%極顯著高于0%。而甘油濃度相同的牛凍精之間的活率差異均不顯著 （P＞0.05）， 見表1。

表1 6種不同甘油濃度的精子凍后平均活率比較 （SSR法）

不同甘油濃度對牛精液冷凍后精子頂體完整率的影響差異極顯著 （P＞0.01），甘油濃度為4%顯著高于3%和5%，極顯著高于0%、2%和6%；3%與5%顯著高于2%和6%，極顯著高于0%，3%顯著高于5%；2%顯著高于6%，2%和6%極顯著高于0%。而甘油濃度相同的牛凍精之間的頂體完整率差異均不顯著 （P＞0.05）， 見表2。

3 討論

3.1 甘油對牛精液冷凍時的保護作用

（1）甘油沖淡溶液中溶質的濃度。甘油可以進入精細胞內代替細胞內部分游離水，使游離水連同無機鹽被排出，降低了細胞內溶質的濃度，從而在冷凍時可阻止在-15℃以下引起精子細胞蛋白質變性。

（2）甘油降低了稀釋后精液的冰點，使精液處于過冷狀態(tài)，因此在-15℃以下才結冰，減緩了細胞的皺縮程度和脫水速度。

（3）減少在形成冰晶時滲入細胞內鹽類的數(shù)量。

（4）甘油可以通過細胞膜，在解凍中可以保護精子。

（5）甘油可以保護精子細胞內一部分酶免受凍害而逸出 （GOT）。

表2 6種不同甘油濃度的精子凍后頂體完整率比較 （SSR法）

3.2 甘油濃度對牛精液冷凍后活率影響

試驗結果表明4%的甘油濃度對牛精液冷凍后活率最好，4%的甘油濃度最適宜保護精子的頂體完整。說明4%的甘油濃度可以最好的保護精子細胞，并且能夠將損害作用降到最低。雖然甘油濃度＜4%時 （2%、3%）對精子的損害程度要好于甘油濃度＞4%時 （5%、6%），但是甘油濃度＜4%時 （2%、3%）對精子細胞冷凍時的保護效果要差于甘油濃度＞4%時 （5%、6%）。

3.3 試驗結論

發(fā)現(xiàn)甘油濃度過低就不能形成對精子細胞的保護，使得精子遭受冷打擊造成精子冷休克和死亡；而甘油濃度過高，容易產(chǎn)生滲透損傷或對精子造成毒害作用使精子慢性中毒，因為甘油濃度過高使得稀釋液中滲透壓明顯升高，這種高滲透壓導致精子頂體破損比例升高，精子細胞中GOT酶泄出量增加。本試驗證明甘油在牛冷凍精液稀釋液的添加濃度為4%時，不但足以保護精子細胞，而且可以在冷凍過程中將損害降到最小，表明4%的甘油濃度對牛精子冷凍的效果最好。