陳余娟

(四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川成都 610100)

mrc-5細(xì)胞是來源于一個27歲的健康婦女(瑞典)的14周男性胚胎,該細(xì)胞核型為46XY,衰老期為48群體倍增代。MRC-5原始種子庫為7代細(xì)胞,共481支。2005年該委員會向WHO建議并被批準(zhǔn)建立了新的細(xì)胞庫,細(xì)胞代次為12代。MRC-5細(xì)胞株是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦的可以用于人用疫苗生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)人二倍體細(xì)胞株,其免疫原性好,具有良好的耐受性,無異種移植致癌性,無外源因子污染,其規(guī)?；囵B(yǎng)適宜生產(chǎn)多種病毒性疫苗。到目前為止,mrc-5細(xì)胞被世界各地很多疫苗生產(chǎn)廠家用于疫苗生產(chǎn),比如人二倍體細(xì)胞狂犬疫苗(HDCV)。

1 材料

1.1 生物反應(yīng)器

中國廣州奇志公司生產(chǎn)的BC-15L(工作體積12L)以及BC-100L型(工作體積80L)微載體培養(yǎng)系統(tǒng)。

1.2 細(xì)胞

中國成都康華生物制品有限公司MRC-5工作細(xì)胞庫細(xì)胞,23代。

1.3 微載體

GE公司的cytodex I 型,按照廠家指導(dǎo)進(jìn)行制備和滅菌處理,使用濃度5g/l-15g/l。

1.4 培養(yǎng)液

日本株式會社的MEM培養(yǎng)液,補(bǔ)加10%的小牛血清(山西太原潤生),0.03%L-谷氨酰胺,1%非必須氨基酸(Gbico)。

1.5 消化液

0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。

1.6 細(xì)胞洗滌液

pH7.2 0.01mol/l PBS溶液

2 方法

2.1 mrc-5細(xì)胞的準(zhǔn)備

將MRC-5細(xì)胞復(fù)蘇,并在2000ml K氏瓶中培養(yǎng)擴(kuò)增,培養(yǎng)條件為pH7.2—7.4、36-37℃、3%-5%CO2、待細(xì)胞長成致密單層后,消化、收集細(xì)胞懸液。

2.2 微載體培養(yǎng)mrc-5細(xì)胞

2.2.1 微載體處理

cytodex I型微載體,按照GE公司說明將微載體用pH7.2 0.01mol/LPBS水化膨脹,高壓滅菌,用培養(yǎng)液置換1-2次后,浸泡2小時以上,備用。

2.2.2 細(xì)胞接種

將細(xì)胞懸液接種到BC-15L細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi),接種密度(1×105個/ml),培養(yǎng)濃度5g/L。設(shè)置好培養(yǎng)參數(shù)(溫度37℃,pH7.2,DO50%,轉(zhuǎn)速40rpm)進(jìn)行培養(yǎng),每天更換營養(yǎng)液,細(xì)胞在微載體上長滿單層后可進(jìn)行二級放大。

圖2

2.2.3 微載體培養(yǎng)二級放大

種子罐細(xì)胞長滿后,用PBS洗滌細(xì)胞三次,加入0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液(30ml/g)消化細(xì)胞,轉(zhuǎn)速150rpm,消化5、10、15、20分鐘后取樣觀察細(xì)胞狀態(tài)并測定細(xì)胞活力,細(xì)胞從載體上脫離下來后,按比例將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入到BC-100L細(xì)胞培養(yǎng)罐擴(kuò)增,設(shè)置好培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3 臺盼藍(lán)染色法計(jì)細(xì)胞密度和活力

健康的細(xì)胞能夠排斥臺盼藍(lán),而死亡細(xì)胞被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色,依據(jù)此原理可通過血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù),來判斷細(xì)胞的存活率。

3 結(jié)果

消化cytodex1上的細(xì)胞,5min,10min,15min,20min時取樣觀察細(xì)胞消化狀態(tài)并拍照,測定細(xì)胞活力（圖1）。

加入消化液后,高速攪拌使消化液均勻作用于每個微載體上的細(xì)胞,同時也對微載體上的細(xì)胞產(chǎn)生剪切力,至細(xì)胞損傷,降低細(xì)胞的活力,所以選擇一個可接受的消化狀態(tài)對微載體的二級放大是非常重要的,因?yàn)槿绻d體上的細(xì)胞未完全脫落時,或是細(xì)胞成團(tuán)狀而未成單個細(xì)胞懸液時,又或是細(xì)胞消化過度活力降低時都會影響細(xì)胞的再次貼壁和培養(yǎng)。

從上圖我們可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)加入消化液5min微載體大多聚集在一起,成團(tuán)狀,細(xì)胞有回縮現(xiàn)象,僅少數(shù)細(xì)胞脫離載體,處理10min,載體上80%的細(xì)胞已經(jīng)脫落,細(xì)胞活力95%,處理15min,細(xì)胞95%從微載體上脫落,且形成單個分散的懸液,細(xì)胞活力92%,處理20min,細(xì)胞完全脫離微載體,此時的細(xì)胞活力為85%。因此,選擇0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化液作用15min作為mrc-5細(xì)胞微載體消化的最佳時間。

4 討論

生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)過程從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大到中試甚至于工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的過程中,如何有效的放大一直是生產(chǎn)中的難點(diǎn)(1)。有報(bào)道研究是在微載體培養(yǎng)過程中直接將上一級培養(yǎng)物(長滿細(xì)胞的微載體)作為種子接入到下一級生物反應(yīng)器中,通過在舊球和新球的重新分配而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大培養(yǎng)(2),這種培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單,污染機(jī)會小,微載體利用率高,可以連續(xù)使用,但是新舊載體上的細(xì)胞處于不同的生長狀態(tài),最終舊載體上長滿細(xì)胞而新載體尚未長滿,空球率高,細(xì)胞生長沒有明顯的對數(shù)生長期,這反應(yīng)了細(xì)胞群體中細(xì)胞的生理狀態(tài)有明顯的差別,細(xì)胞代次不一致,不符合于藥品生產(chǎn)的要求。試驗(yàn)結(jié)果表明使用0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化液在BC-15L生物反應(yīng)器內(nèi)150rpm,消化10-15鐘可獲得活力高且分散均勻的mrc-5細(xì)胞懸液。

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