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        銀杏達(dá)莫注射液對血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶及海馬區(qū)神經(jīng)元干預(yù)作用

        2015-12-02 09:45:25王艷王珂
        現(xiàn)代儀器與醫(yī)療 2015年6期
        關(guān)鍵詞:血管性癡呆

        王艷 王珂

        [摘 要] 目的:觀察銀杏達(dá)莫注射液對血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶及海馬區(qū)神經(jīng)元干預(yù)作用。 方法:大鼠分為三組:假手術(shù)組、安慰劑組、銀杏達(dá)莫組。采用改良雙側(cè)頸總動脈阻斷方法制備血管性癡呆大鼠模型。利用Morris水迷宮評價大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,顯微鏡觀察海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果:與假手術(shù)相比,安慰劑組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(P<0.05),而銀杏達(dá)莫組大鼠平均潛伏期較安慰劑組明顯減少(P<0.05)。形態(tài)學(xué)觀察顯示安慰劑組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量較少,甚至神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡。銀杏達(dá)莫組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目、形態(tài)較安慰劑組均有明顯改善。結(jié)論:銀杏達(dá)莫注射液對VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用,從而改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

        [關(guān)鍵詞] 血管性癡呆;大鼠;銀杏達(dá)莫;海馬區(qū);學(xué)習(xí)記憶

        中圖分類號:R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B 文章編號:2095-5200(2015)06-030-03

        DOI:10.11876/mimt201506012

        血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是指各種腦血管疾病引起腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合癥,以高級神經(jīng)認(rèn)知功能障礙,如學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能受損等為主要表現(xiàn),可伴有一系列異常神經(jīng)心理癥狀和精神行為,是繼阿爾茨海默病之后第二大癡呆疾。VD可以防治,早期治療,具有可逆性[1-2]。目前,已有文獻(xiàn)報道:銀杏達(dá)莫注射液具有改善腦部微循環(huán)、營養(yǎng)神經(jīng)、清除自由基、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,改善由于腦缺血引起癥狀和記憶功能等功效[3]。銀杏達(dá)莫注射液對血管性癡呆具有較好臨床療效,但機(jī)制研究證據(jù)較少。本研究在動物模型上觀察銀杏達(dá)莫注射液對血管性癡呆治療效果及可能的治療機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        實驗對象為健康雄性SD大鼠,數(shù)量30只,體重在250~300g,SPF級。OPJ-1B型切片機(jī)由天津天利航空機(jī)電有限公司生產(chǎn);80i正置顯微鏡由日本Nikon生產(chǎn);Morris水迷宮由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制生產(chǎn)。銀杏達(dá)莫注射液(國藥準(zhǔn)字H52020032),由貴州益佰制藥股份有限公司生產(chǎn)。

        1.2 實驗方法與分組

        SD大鼠經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng),采用Morris水迷宮篩選實驗動物,淘汰不能勝任水迷宮大鼠。將符合要求大鼠隨機(jī)選出20只,改良雙側(cè)頸總動脈阻斷方法制備血管性癡呆動物模型,余下10只為假手術(shù)組,給予相應(yīng)手術(shù)處理但不阻斷雙側(cè)頸總動脈。手術(shù)死亡大鼠剔除實驗,并補充相應(yīng)數(shù)目大鼠。術(shù)后第2天將造模大鼠,隨機(jī)分為2組:銀杏達(dá)莫組給予銀杏達(dá)莫注射液(劑量為2.7mg/kg)靜脈注射 [4],安慰劑組、假手術(shù)組給予等體積生理鹽水靜脈注射,療程為2周[5]。治療結(jié)束后,利用Morris水迷宮裝置對各組大鼠進(jìn)行定位航行試驗,記錄各組大鼠逃避潛伏期。

        1.3 制備血管性癡呆動物模型

        改良雙側(cè)頸總動脈(CAA)阻斷法制備血管性癡呆模型[6]。術(shù)前12h禁食,10%水合氯醛(350mg/kg體重)腹腔麻醉,取仰臥位,固定于手術(shù)臺上;行相關(guān)手術(shù)前準(zhǔn)備,頸部正中切口,依次切開皮膚、皮下組織,分離肌肉、血管、神經(jīng),充分暴露一側(cè)頸總動脈,給予結(jié)扎、剪斷該血管;依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚。間隔7天后,同樣方法再次處理對側(cè)頸總動脈。

        1.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測定

        利用Morris水迷宮對各組大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶評估[7]。定位航行實驗(水下任務(wù)實驗),記錄大鼠從入水至爬上平臺時間,即逃避潛伏期。逃避潛伏期長短可以客觀反映大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。連續(xù)進(jìn)行5天定向航行試驗,每日4次(上午、下午各2次)。大鼠第5天4次平均逃避潛伏期為該大鼠最終測試時間。

        1.5 大鼠腦組織HE切片

        大鼠經(jīng)10%水合氯醛(350mg/Kg)腹腔麻醉,經(jīng)心臟灌注生理鹽水50mL,再用含2%多聚甲醛、1%戊二醛混合液100~250mL灌注固定,時間不超過6min,1h后取腦,每個標(biāo)本放入4%多聚甲醛PBS溶液中固定4~6h,沿矢狀位切成小塊,在30%蔗糖溶液中脫水12h后包埋于石蠟中。采用蘇木素-伊紅(HE染色)腦組織切片,光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

        應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)用x±s表示。

        2 結(jié)果

        2.1 三組大鼠癥狀表現(xiàn)

        雙側(cè)頸總動脈假阻斷術(shù)后當(dāng)日大鼠表現(xiàn)為運動減少、進(jìn)食及飲水較少,之后逐漸恢復(fù)。術(shù)后2周時假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)為進(jìn)食水、活動及精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度恢復(fù)至術(shù)前水平。安慰劑組表現(xiàn)為大鼠進(jìn)食、飲水逐漸恢復(fù),目光遲鈍,活動量較術(shù)前明顯減少,毛發(fā)臟亂,缺少光澤,對外界刺激反應(yīng)淡漠。銀杏迖莫組大鼠表現(xiàn)為活動量較手術(shù)前稍減少、毛發(fā)粗糙、欠光澤,對外界反應(yīng)遲鈍。

        2.2 大鼠定位航行試驗

        假手術(shù)組平均逃避潛伏期為(12.91±4.86)s;安慰劑組平均逃避潛伏期為(36.92±7.64)s。與假手術(shù)組相比,血管癡呆組平均逃避潛伏期明顯延長(P<0.05),說明該組SD大鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶功能受損。而銀杏達(dá)莫組大鼠平均逃避潛伏期為(28.23±7.21)s。與安慰劑組相比,銀杏達(dá)莫組平均逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05),但與假手術(shù)組相比,銀杏達(dá)莫組平均逃避潛伏期仍延長(P<0.05)。

        2.3 銀杏達(dá)莫對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元

        影響

        假手術(shù)組SD大鼠腦海馬CA1區(qū)HE染色顯示:海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞呈圓形或橢圓型,細(xì)胞核染成淡藍(lán)色,與細(xì)胞槳界限清晰,細(xì)胞排列緊密,外形規(guī)則,呈3~5層排列,未見異常結(jié)構(gòu)(見圖A)。安慰劑組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色可見:海馬錐體細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞數(shù)目明顯減少,細(xì)胞核與胞漿分界不清,出現(xiàn)核固縮、變形,可見軟化灶、細(xì)胞壞死明顯(見圖B)。銀杏達(dá)莫組海馬區(qū)組織切片可見:細(xì)胞體積變大,細(xì)胞水腫,細(xì)胞局部壞死;細(xì)胞排列較整齊,可見多層排列輪廓,海馬CA1神經(jīng)元數(shù)目、形態(tài)較安慰劑組均有明顯改善(見圖C)。

        3 討論

        銀杏達(dá)莫注射液是以銀杏葉提取物為基礎(chǔ)復(fù)合制劑,主要有效成分為銀杏內(nèi)酯類、銀杏黃酮苷、百果內(nèi)酯、雙嘧達(dá)莫等;具有改善微循環(huán)、抗血小板聚集、清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等多重藥理作用,可以防止細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、拮抗谷氨酸等興奮性氨基酸引起神經(jīng)毒性[8-9]。大量臨床研究發(fā)現(xiàn),銀杏達(dá)莫注射液對血管性癡呆治療預(yù)防療效確切,但其治療血管性癡呆機(jī)制尚未闡明[5,10]。本研究通過觀察銀杏達(dá)莫注射液對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞影響,探討VD發(fā)病機(jī)制和銀杏達(dá)莫治療VD作用機(jī)制。

        本實驗采用Morris水迷宮評價大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力,其所測量指標(biāo)為大鼠逃避潛伏期;逃避潛伏時間越長,學(xué)習(xí)記憶能力越差。本研究顯示:銀杏達(dá)莫組大鼠平均逃避潛伏期較安慰劑組明顯縮短(P<0.05);但與假手術(shù)組相比,銀杏迖莫組平均逃避潛伏期仍延長(P<0.05)。因此,該研究表明銀杏達(dá)莫注射液可以有效改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,但不能使其達(dá)到正常大鼠學(xué)習(xí)記憶水平。

        海馬作為大腦邊緣系統(tǒng)主要組成部分,參與學(xué)習(xí)、記憶、情緒調(diào)節(jié)等功能活動,被認(rèn)為學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵腦區(qū)[11]。臨床上,學(xué)習(xí)記憶受損常是血管性癡呆患者首發(fā)和較為突出癥狀。研究表明,血管性癡呆患者學(xué)習(xí)記憶受損與海馬區(qū)神經(jīng)元變性、壞死、凋亡關(guān)系密切[12-15]。本研究也顯示:銀杏達(dá)莫組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞較少表現(xiàn)為變性、壞死及凋亡特征,其神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯多于安慰劑組。海馬與動物學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切。由此可以推測,銀杏達(dá)莫改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,其可能通過增強海馬區(qū)神經(jīng)元對缺氧耐受、抑制海馬區(qū)神經(jīng)元壞死及凋亡、修復(fù)損傷神經(jīng)等多靶點調(diào)控機(jī)制,從而保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量及功能。

        綜上所述,本研究顯示:銀杏達(dá)莫注射液通過對海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用,顯著改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,其可能機(jī)制為減輕腦缺血再灌注損傷,抑制海馬神經(jīng)元壞死、凋亡,修復(fù)神經(jīng)損傷。但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

        參 考 文 獻(xiàn)

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