呂江（河北省張家口市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 075000）丁勇（河北省懷安動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 076150）

自擬治療弓形蟲(chóng)病中藥復(fù)方的篩選試驗(yàn)

呂江（河北省張家口市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 075000）丁勇（河北省懷安動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 076150）

研究以尋求高效、安全治療弓形蟲(chóng)病的復(fù)方中藥為目的，用自擬治療弓形蟲(chóng)病的方劑對(duì)人工感染的小白鼠進(jìn)行復(fù)方中藥的篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明，篩選出的復(fù)方中藥是低毒、安全、療效確切的抗弓形蟲(chóng)病藥物，為臨床應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

中藥方劑；弓形蟲(chóng)；篩選試驗(yàn)；安全性試驗(yàn)

弓形蟲(chóng)病是剛第弓形蟲(chóng)引起的一種人和多種動(dòng)物共患寄生蟲(chóng)病。這一病原體于1908年由Nicolle和Manceaux在北非突尼斯的嚙齒類(lèi)梳趾鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并正式命名?，F(xiàn)在豬弓形蟲(chóng)病多以隱性感染、繼發(fā)和并發(fā)感染等形式存在于一些豬場(chǎng)。不少病例報(bào)告以及血清學(xué)調(diào)查結(jié)果證明，豬弓形蟲(chóng)病仍然是養(yǎng)豬生產(chǎn)以及公共衛(wèi)生的一大隱患[1]。因此，本病給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)很大危害和威脅。鑒于原有常用治療藥物，包括磺胺類(lèi)、乙胺嘧啶、螺旋霉素及氯化林可霉素等，單或聯(lián)用，均存在療程長(zhǎng)，毒副反應(yīng)較多，療效尚不理想、且不能根治等問(wèn)題，迫切需要探索新的治療方法和尋找抗弓形蟲(chóng)藥[2]。針對(duì)存在問(wèn)題，我們進(jìn)行本試驗(yàn)，為尋求一種簡(jiǎn)便、高效治療弓形蟲(chóng)病的中藥方劑提供一定的理論根據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

小白鼠為河北北方學(xué)院物資科動(dòng)物室繁殖的昆明種，體重為18～25g的健康小白鼠，雌雄各半。

試驗(yàn)藥物：方劑一：黃芪、白術(shù)、青蒿、草果、檳榔。方劑二：黃芩、甘草、檳榔、黃芪。所有中藥均購(gòu)自張家口市南山堂大藥房。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 弓形蟲(chóng)速殖子懸液的制備

將本室保種的RH株弓形蟲(chóng)速殖子常規(guī)腹腔接種小鼠數(shù)只，72h后斷頸處死，收集腹水，用生理鹽水洗滌并稀釋?zhuān)狄曇跋掠?jì)數(shù)，調(diào)整蟲(chóng)數(shù)濃度至5×104/ml，試驗(yàn)時(shí)每只小鼠腹腔注射0.2ml。

1.2.2 復(fù)方中藥的制備

復(fù)方中藥水煎液的制備：將配好的復(fù)方中藥置砂鍋內(nèi)，加入6～8倍的冷水浸泡30～60min，用火加熱，開(kāi)始用強(qiáng)火，沸后改用文火，煮沸30min，用紗布過(guò)濾。藥渣加3～5倍量水繼續(xù)按上法煎煮，沸后煎煮30min，濾過(guò)，合并得兩次濾液，于水浴上濃縮成每毫升相當(dāng)于原藥材1g的藥液，即配成100%的水煎劑，經(jīng)高壓滅菌20min，冷卻后置冰箱中備用。試驗(yàn)前按需要稀釋。

復(fù)方中藥醇提液的制備：取原藥100g，加95%乙醇200ml浸泡24h，傾取上層液過(guò)濾于蒸發(fā)皿內(nèi)，殘留再加100ml乙醇提取二次，合并提取液濾液，自然干燥得提取物。提取率為9.12%。臨用前按需要進(jìn)行稀釋。

1.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組

篩選試驗(yàn)60只感染弓形蟲(chóng)的小鼠隨機(jī)分為3組，每組20只，第1組為弓形蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照組（A組）；第2組為方劑一治療組（B組），第3組為方劑二治療組（C組），感染弓形蟲(chóng)4h后灌胃，每次0.5ml，連續(xù)14天給藥，每天1次；另取20只未感染小鼠每天灌胃0.5ml生理鹽水作為對(duì)照組（D 組）。

急性毒性試驗(yàn)：取健康小白鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，每組5只，分別采用水煎劑灌胃和腹腔注射醇提液兩種給藥途徑，按每kg體重5g、10g和15g三個(gè)劑量，使用時(shí)加適當(dāng)?shù)乃姑恐恍“资蠊辔噶吭?.5ml。

亞慢性毒性試驗(yàn)：取健康小白鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為3組，每組10只，第1組為對(duì)照組，第2組和第3組分別將復(fù)方中藥按10%和20%比例混入小白鼠飼料中，然后做成塊狀飼料喂給小白鼠。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中藥的篩選試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 自擬方劑對(duì)正常小鼠影響

生理鹽水對(duì)照組小鼠在給藥期間未出現(xiàn)異常反應(yīng)，小鼠死亡時(shí)間與正常小鼠死亡時(shí)間差別無(wú)顯著性（P＞0.05），表明自擬方劑對(duì)小鼠無(wú)明顯毒害作用。

2.1.2 自擬方劑對(duì)感染小鼠腹水中弓形蟲(chóng)數(shù)量的影響

在感染弓形蟲(chóng)24h和72h分別從各組隨機(jī)取5只小鼠解剖，其中常規(guī)腹腔接種RH株弓形蟲(chóng)速殖子的小白鼠72h后大腸嚴(yán)重便秘，腹水明顯增多，取腹水計(jì)數(shù)蟲(chóng)體。結(jié)果見(jiàn)圖1，2，表1。生理鹽水對(duì)照組小鼠于存活1月后解剖，取腹水鏡檢，未見(jiàn)蟲(chóng)體。

圖1 常規(guī)腹腔接種RH株弓形蟲(chóng)速殖子的小白鼠72h后大腸便秘

圖2 常規(guī)腹腔接種RH株弓形蟲(chóng)速殖子的小白鼠72h后腹水明顯增多

表1 感染弓形蟲(chóng)24h和72h小白鼠腹水中蟲(chóng)數(shù)（個(gè)/ml）

2.1.3 各試驗(yàn)組小白鼠平均存活天數(shù)的比較

陽(yáng)性對(duì)照組小白鼠平均存活5.6d，方劑二治療組小白鼠平均存活12.8d，生理鹽水對(duì)照組小鼠在第21天時(shí)死亡1只。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與陽(yáng)性對(duì)照組小白鼠生存時(shí)間相比，方劑二治療組小白鼠生存時(shí)間有顯著性延長(zhǎng)（P＜0.01）。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 復(fù)方中藥的安全性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 急性毒性試驗(yàn)

用藥后每天觀察小白鼠的狀況，連續(xù)7天，各組小白鼠均無(wú)死亡，未出現(xiàn)中毒癥狀。在此基礎(chǔ)上，另取20只小白鼠分成兩組，按kg體重20g劑量采用上述兩種途徑給藥，24h內(nèi)未見(jiàn)死亡，72h后又重復(fù)給藥一次，并連續(xù)觀察7天，小白鼠無(wú)死亡，且健康活潑，食欲良好。結(jié)果表明該復(fù)方中藥LD50＞20g/kg，按急性毒性分級(jí)屬無(wú)毒物。

2.2.2 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

在90天試驗(yàn)期內(nèi)觀察，各組小白鼠飲食、糞便、體態(tài)、運(yùn)動(dòng)、聲、光反射均未見(jiàn)異常，無(wú)死亡。血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)、肝體比和腎體均屬正常（表3、表4）。采血致死后尸體剖檢，各組小白鼠心、肝、脾、肺和腎的大小、顏色、質(zhì)地均未見(jiàn)異常。

3 結(jié)論與討論

自擬方劑陰性對(duì)照組小鼠在用藥期間無(wú)任何不良反應(yīng)，且其生存時(shí)間與正常小鼠生存時(shí)間一致，表明自擬方劑本身毒性較小，與文獻(xiàn)報(bào)道的乙胺嘧啶的毒副作用（肝腎功能的損害，骨髓抑制、過(guò)敏、致畸及消化道不適等不良反應(yīng)）則有明顯的差異[3]。因此自擬方劑是低毒可靠的藥物。

表2 試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組小白鼠平均存活天數(shù)的比較

表3 血常規(guī)檢查結(jié)果

表4 肝體比、腎體比測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)觀察了感染弓形蟲(chóng)后不同時(shí)間（24h、72h和死亡后）各試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腹水中蟲(chóng)體數(shù)量的變化，結(jié)果表明自擬方劑經(jīng)口灌服能明顯減少感染小鼠腹水中蟲(chóng)體數(shù)量，表明自擬方劑能明顯抑制弓形蟲(chóng)的繁殖。同時(shí)從表1可見(jiàn)方劑二對(duì)感染小鼠腹水中弓形蟲(chóng)數(shù)量的影響更顯著（P＜0.01），通過(guò)進(jìn)一步觀察小鼠存活天數(shù)，方劑二能有效延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，治療效果更明顯，方劑組成更合理。該方劑中黃芪補(bǔ)氣，檳榔殺蟲(chóng)，黃芩抗菌、解毒，甘草調(diào)和諸藥，顯著提高機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，從而提高了藥物的使用效率[4,5]。

弓形蟲(chóng)Rh株屬于強(qiáng)毒株，小白鼠感染1個(gè)滋養(yǎng)體后即可引起死亡。感染10個(gè)滋養(yǎng)體7～8d內(nèi)死亡率達(dá)100%。Grimwood（1980）腹腔接種小白鼠后，小白鼠平均存活5d[6]。曾艷波等報(bào)道，小鼠感染弓形蟲(chóng)后，死亡時(shí)間通常在5.5～7d[7]。于恩庶報(bào)道試驗(yàn)小鼠3d內(nèi)全部死亡。本試驗(yàn)方劑二治療組平均存活時(shí)間為12.8d，是對(duì)照組存活時(shí)間（5.6d）的2倍多，按照徐淑云[8]療效判定標(biāo)準(zhǔn)判定方劑二治療弓形蟲(chóng)病有效。

復(fù)方中藥對(duì)小鼠進(jìn)行的急性毒性試驗(yàn)和亞慢性毒性試驗(yàn)，采用水煎劑醇提液兩種給藥途徑，按kg體重5g、10g和15g三個(gè)劑量以及在90天試驗(yàn)期內(nèi)的觀察。結(jié)果表明，用藥后各組小白鼠均無(wú)死亡，未出現(xiàn)中毒癥狀。血常規(guī)檢查、肝體比、腎體比、尸體剖檢、病理組織切片檢查均無(wú)異常。說(shuō)明該復(fù)方藥物在適宜劑量時(shí)屬無(wú)毒物。本試驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行的急性毒性試驗(yàn)和亞慢性毒性試驗(yàn)觀察，采用兩種給藥途徑，三個(gè)劑量證明該方劑在適宜劑量時(shí)安全可靠的。

綜上所述，自擬復(fù)方中藥是低毒，療效確切的抗弓形蟲(chóng)藥物，為臨床應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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[8]徐淑云.藥物試驗(yàn)方法學(xué)習(xí)[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1995:13-20.

河北省教育廳自然基金項(xiàng)目（2007103）。

丁勇（1970.3-），男，畜牧獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)臨床、實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)、疾病預(yù)警、動(dòng)物疫病防控技術(shù)、生物制品研究與推廣工作。