丁 妍，丁 敏，賈曉斌，張勇妹，郭貴賓，孫 銳，林 梅

0 引 言

康復(fù)靈顆粒由黃芪、當(dāng)歸、桑葚等5味中藥制成，臨床上主要用于治療輻射損傷。方中，君藥黃芪為中醫(yī)常用的重要補氣藥，所含黃酮、皂苷、多糖類化合物為其主要活性成分［1-4］。當(dāng)歸具有補血活血的作用，在防治輻射方面應(yīng)用廣泛［5-6］。但相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚未建立，為有效控制本制劑質(zhì)量，本文采用薄層色譜法對方中黃芪、當(dāng)歸進行定性鑒別，同時采用高效液相色譜法對黃芪甲苷進行定量測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Waters，600型泵，717自動進樣器，蒸發(fā)光散射檢測器檢測器，Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))?？祻?fù)靈顆粒 (由解放軍第三五九醫(yī)院提供);黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:110781-201314);阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:110773-201313);乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芪鑒別 方法參照文獻［7-8］，取本制劑6 g，加甲醇40 mL，水浴，回流提取1 h，過濾，上樣于中性Al2O3柱(100～120目，5 g，內(nèi)徑為10～15 mm)。用40%甲醇200mL洗脫，將收集的洗脫液水浴蒸干，然后加水60 mL溶解殘渣，用水飽和的正丁醇溶液萃取2次，每次40 mL，將正丁醇萃取液合并后用水洗滌2次，每次40mL，水浴蒸干正丁醇液，加甲醇1 mL溶解殘渣，作為供試品溶液。按照處方比例制成缺黃芪藥材的陰性樣品，并按供試品溶液的制備方法制成缺黃芪的陰性樣品溶液。稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解，制備成1mg/mL的對照品溶液。按照薄層色譜法進行操作，分別吸取上面所述3種溶液各2 μL，點樣于同一塊硅膠G薄層板上，三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液作為展開劑，將點樣的薄層板放于展開缸中展開，待展開劑展開至目標(biāo)前沿位置取出，通風(fēng)櫥中晾干，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，噴完后用烘箱加熱，至斑點顯色清晰取出。供試品的色譜圖中，與對照品色譜對應(yīng)的位置上，日光下顯示相同的棕褐色斑點，陰性對照無斑點，紫外燈(365 nm)下顯示相同的熒光斑點，陰性對照無斑點，見圖1。

2.1.2 當(dāng)歸鑒別 方法參照文獻［9-10］，取本制劑6 g，加1%NaHCO3溶液50 mL，超聲提取 10 min，離心，上清液用稀HCl調(diào)節(jié)pH值至2～3，乙醚萃取2次，每次40mL，將乙醚液合并后揮干，加甲醇1mL溶解殘渣，作為供試品溶液。按照處方比例和制法制成缺當(dāng)歸藥材的陰性顆粒劑，并按照供試品溶液的制備方法制成缺當(dāng)歸的陰性樣品溶液。稱取阿魏酸對照品適量，加甲醇溶解，制備成1mg/mL的對照品溶液。按薄層色譜法進行操作，分別吸取上面所述3種溶液各10 μL，點樣于同一塊硅膠G薄層板上，環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)作為展開劑，將點樣的薄層板放于展開缸中展開，待展開劑至目標(biāo)前沿位置取出，通風(fēng)櫥中晾干，放在紫外燈箱(365 nm)下觀察。與對照品色譜對應(yīng)的位置上，供試品顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照液在該位置無此斑點。見圖2。

圖1 黃芪甲苷薄層色譜Figure 1 Identification of as tragalosideⅣby TLC

圖2 當(dāng)歸薄層色譜鑒別Figure 2 Identification of ferulaic acid

2.2 含量測定

2.2.1 黃芪含量測定 ①色譜條件，色譜柱:Agilent Zorbax Extend-C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(32∶68)，ELSD 檢測;流速1.0 mL/min;柱溫:35℃。②對照品儲備液的制備，稱取黃芪甲苷對照品，精密稱定，置容量瓶中加甲醇溶解并稀釋至容量瓶刻度，制成1.53mg/mL的母液。③供試品溶液的制備，取本品約10 g，用分析天平精密稱定，放在索氏提取器中，用甲醇100 mL冷浸24 h，然后加甲醇適量，水浴，回流提取4 h，回收溶劑，蒸干，加水10 mL溶解殘渣，用水飽和的正丁醇溶液萃取4次，每次40 mL，合并萃取液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，水浴蒸干正丁醇液，加水5 mL溶解殘渣，放冷，上樣于D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為 12 cm)，依次用水 50 mL、40% 乙醇30 mL、70%乙醇80 mL洗脫，收集最后的洗脫液，水浴蒸干，加適量甲醇溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，并加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。④線性關(guān)系考察，精密量取對照品儲備液 0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣20 μL，以濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸。得到回歸方程:

Y=5.9 ×107X-42572

R2=0.999(n=5)，結(jié)果表明黃芪甲苷在0.0306～0.6120 mg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好。⑤精密度試驗，精密吸取“2.2.2”項下第3 份對照品溶液20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣20 μL，重復(fù)操作6次，記錄色譜峰面積。計算黃芪甲苷的峰面積RSD為1.89%，表明本方法精密度良好。⑥重復(fù)性考察，分別精密稱取同一批號康復(fù)靈顆粒6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“3.1.1”項下色譜條件進樣 20 μL，記錄色譜峰面積。計算黃芪甲苷的峰面積RSD為1.58%，表明本方法重復(fù)性良好。⑦穩(wěn)定性考察，取同一康復(fù)靈顆粒供試品溶液，于室溫放置，分別于2、4、6、8、12、18、24 h 按“2.2.1”項下色譜條件進樣 20 μL，記錄色譜峰面積。計算黃芪甲苷峰面積的RSD為2.17%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。⑧加樣回收率考察，供試品取樣量為原樣品量的50%，根據(jù)被測成分含量，按1∶1加入黃芪甲苷對照品各6份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣 20 μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果黃芪甲苷的平均加樣回收率為101.26%，表明本方法回收率良好。⑨樣品中黃芪甲苷含量測定，取康復(fù)靈顆粒10批，按“2.2.1”項下方法制備溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算黃芪甲苷的含量。

根據(jù)上述測定結(jié)果，暫定本品按干燥品計算，每克含黃芪甲苷(C41H68O14)的量不得少于0.19 mg。10個批次康復(fù)靈顆粒中黃芪甲苷分別為0.231、0.245、0.239、0.242、0.228、0.221、0.229、0.235、0.246、0.253 mg/g。

2.2.2 當(dāng)歸含量測定 ①色譜條件，色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱 (250mm ×4.6mm，5μm);流動相:乙腈-0.085%磷酸水(17∶83)，檢測波長:320 nm;流速1.0 mL/min;柱溫:35℃。②對照品儲備液的制備，取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成12 μg/mL的母液。③供試品溶液的制備，取本品約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。④線性關(guān)系考察，精密量取對照品儲備液0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL，分別置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣 20 μL，以濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸。得到回歸方程:

Y=4.4 ×106X+7342

R2=0.999(n=5)，結(jié)果表明黃芪甲苷在0.24 ～4.80μg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好。⑤精密度試驗，精密吸取“2.2.2”項下第3份對照品溶液20 μL，按“2.2.2”項下色譜條件進樣 20 μL，重復(fù)操作6次，記錄色譜峰面積。計算阿魏酸的峰面積RSD為0.83%，表明本方法精密度良好。⑥重復(fù)性考察，分別精密稱取同一批號康復(fù)靈顆粒6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣20μL，記錄色譜峰面積。計算阿魏酸的峰面積RSD為1.14%，表明本方法重復(fù)性良好。⑦穩(wěn)定性考察，取同一康復(fù)靈顆粒供試品溶液，于室溫放置，分別于 2、4、6、8、12、18、24 h 按“2.2.2”項下色譜條件進樣20μL，記錄色譜峰面積。計算阿魏酸峰面積的RSD為1.37%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。⑧加樣回收率考察，供試品取樣量為原樣品量的50%，根據(jù)被測成分含量，按1∶1加入阿魏酸對照品各6份，按“2.2.2”項下色譜條件進樣20 μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果阿魏酸的平均加樣回收率為98.39%，表明本方法回收率良好。⑨樣品中阿魏酸含量測定，取康復(fù)靈顆粒10批，按“2.2.2”項下方法制備溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，用外標(biāo)一點法計算阿魏酸的含量。

根據(jù)上述測定結(jié)果，暫定本品按干燥品計算，每克含阿魏酸(C10H10O4)的量不得少于0.08 mg。10個批次康復(fù)靈顆粒中阿魏酸含量分別為0.092、0.103、0.112、0.096、0.115、0.086、0.082、0.107、0.094、0.088 mg/g。

3 討 論

對康復(fù)靈顆粒中臣藥當(dāng)歸進行含量測定前，需對其進行提取。近年來，關(guān)于當(dāng)歸的提取的方法主要有水提、醇提、超臨界流體萃取及雙提等工藝［11］。鑒于阿魏酸在醇提取液中濃度高于水煎液，在提取康復(fù)靈顆粒時舍棄水提取工藝。查閱藥典及相關(guān)文獻，我們采用70%甲醇對康復(fù)靈顆粒進行提?。?］。

伴隨著放射性核素在醫(yī)療、能源、戰(zhàn)爭等方面的普遍應(yīng)用，人們愈來愈重視核輻射對機體的損傷及醫(yī)學(xué)防護。長期以來，雖然人們致力于尋找安全有效、價格合理的抗放療藥物，但是成效甚微。近年來，研究發(fā)現(xiàn)中藥在抗輻射方面具有獨特的優(yōu)勢，吸引了越來越多的科學(xué)家關(guān)注［12-14］。中醫(yī)認(rèn)為輻射造成機體氣血受損，其基本病理機制是氣血兩虛及血瘀。本制劑中當(dāng)歸、黃芪具有補氣補血活血的作用，其經(jīng)典組方當(dāng)歸補血湯在臨床上更加應(yīng)用廣泛。

本研究建立了抗輻射中藥康復(fù)靈顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，希望可為同類型抗輻射中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)參考。通過質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，實現(xiàn)全面準(zhǔn)確地控制康復(fù)靈顆粒質(zhì)量，確保并提高其安全性、有效性，以便更好地服務(wù)于臨床。本研究所建立的方法操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，可作為康復(fù)靈顆粒的質(zhì)量控制方法。

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