卜曉敏，王 鋒綜述，汪俊軍審校

0 引 言

microRNA是一類長約19～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，最早于20世紀(jì)90年代在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，其序列、生成過程在進(jìn)化上高度保守，對(duì)生命活動(dòng)的調(diào)控至關(guān)重要［1-3］。miRNA通過與靶mRNA分子的3'非編碼區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶mRNA的翻譯或者特異性地切割靶mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控［1，4］。大量研究表明，miRNA參與細(xì)胞周期，分化及代謝等多種細(xì)胞活動(dòng)，在細(xì)胞的生理和病理活動(dòng)中起著重要作用，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是疾病潛在的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［2，5］。心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是全世界患病率和致死率最高的疾病之一，研究表明CVD患者，特別是早期患者具有特異變化的循環(huán)microRNA。有關(guān)CVD相關(guān)的循環(huán)miRNA的來源、穩(wěn)定的存在形式及其功能的研究已引起廣泛關(guān)注，本文就該領(lǐng)域的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 與心血管疾病相關(guān)的循環(huán)miRNA的來源

1.1 破裂細(xì)胞的被動(dòng)滲漏 研究表明，miRNA可通過組織損傷和細(xì)胞破裂等被動(dòng)滲漏方式釋放入體液，并在體液中穩(wěn)定存在［6-9］。CVD患者血清升高的miRNAs可能來源于心肌損傷以及動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的破裂。如miR-208是心肌組織特異的miRNA，在CVD患者血清/血漿中特異升高;miR-1、miR-133a和miR-499在心肌和骨骼肌中特異表達(dá)，可在心肌損傷和骨骼肌損傷(外科手術(shù)或劇烈運(yùn)動(dòng))后釋放入血［9］。Raitoharju等［10］研究發(fā)現(xiàn)，AS患者斑塊中 miR-21，miR-34，miR-146a，miR-146b-5p和 miR-210水平顯著升高。Scalbert等［11］發(fā)現(xiàn)AS斑塊中與血管生成相關(guān)的微囊泡中miR106a，miR-25，miR92和 miR-21 均顯著高，提示CVD患者血清升高的這些miRNAs可能來源于斑塊的破裂。

1.2 細(xì)胞主動(dòng)分泌 循環(huán)系統(tǒng)中的miRNA除可來源于細(xì)胞的被動(dòng)滲漏外，還可來源于細(xì)胞的主動(dòng)分泌，前者為游離 miRNA，后者為分泌 miRNA。如CVD患者血清升高的miR-126，可來源于內(nèi)皮細(xì)胞的主動(dòng)分泌，并通過影響鄰近細(xì)胞的趨化因子CXCL-12的產(chǎn)生而發(fā)揮保護(hù)血管的作用［12］。AS患者血漿升高的miR-223可來源于血小板的主動(dòng)分泌，miR-150可來源于單核細(xì)胞的分泌，參與AS的發(fā)生、發(fā)展，與 CVD 密切相關(guān)［13-15］。

2 循環(huán)miRNA的存在形式

2008年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA可長期穩(wěn)定存在于血循環(huán)中，能抵抗RNA酶降解，首次將miRNA的研究由胞內(nèi)引向胞外［16-17］。分泌miRNA因具有一定的功能已成為胞外miRNA研究的又一熱點(diǎn)，胞外miRNA的不同存在形式與miRNA的功能密切相關(guān)。

2.1 細(xì)胞外微囊泡包裹 細(xì)胞通過細(xì)胞外囊泡包裹并分泌出miRNA，使miRNA免受核酸酶的降解。目前發(fā)現(xiàn)的可作為miRNA囊泡的主要包括外泌體，脫落囊泡及凋亡小體。外泌體是一種由多泡體產(chǎn)生，通過胞吐釋放，大小在30～100 nm 的囊泡［18］。脫落囊泡主要通過質(zhì)膜向外出芽或分裂產(chǎn)生并釋放，在心血管領(lǐng)域也被稱為微粒，大小在100～1000 nm［19］。外泌體、脫落微泡兩者合稱為微囊泡(microvesicles，MV)。凋亡小體形成于凋亡的終末階段，是最大的細(xì)胞外囊泡，直徑約1～5μm，其內(nèi)含有細(xì)胞器及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物(蛋白質(zhì)，DNA與RNA)［20-21］。在AS過程中凋亡小體可通過將miRNA從凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)輸至周圍的細(xì)胞而傳遞生存或生長信號(hào)［12］。

2.2 與載酯蛋白結(jié)合 Vickers等［22］發(fā)現(xiàn)，血漿miRNA可與高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)結(jié)合，經(jīng)HDL運(yùn)載到達(dá)靶細(xì)胞，如與HDL結(jié)合的miR-223可進(jìn)入肝細(xì)胞并調(diào)節(jié)胞內(nèi)RhoB和Ephrin A1蛋白的表達(dá)，且高膽固醇患者血漿HDL結(jié)合的miRNA表達(dá)譜較正常人差異顯著。Wagner等［23］進(jìn)一步研究證實(shí)，miRNAs在血漿中的運(yùn)輸還可以通過低密度脂蛋白(low densith lipoprotein，LDL)來實(shí)現(xiàn)，如miR-155在LDL中的量遠(yuǎn)高于HDL。

2.3 與Ago2結(jié)合 Ago2是一種RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體的執(zhí)行元件，在細(xì)胞中直接與miRNA結(jié)合并介導(dǎo)對(duì)mRNA的抑制［24］。最近的研究表明，在AS過程中伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的壞死與凋亡，血漿中來源于內(nèi)皮細(xì)胞的miR-126一部分以凋亡小體的形式存在，一部分以與Ago2蛋白結(jié)合的形式存在［25］。與Ago2結(jié)合的miRNA可以穩(wěn)定存在于血漿或血清中，提示Ago2可以使與其結(jié)合的miRNA免受血漿或血清中的核酸酶的降解。

3 分泌miRNA在心血管疾病中的功能

3.1 促進(jìn)心血管疾病發(fā)生

3.1.1 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、遷移 血小板通過與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及血管上皮細(xì)胞相互作用在AS、中風(fēng)等疾病中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在促血小板生成素或凝血酶的作用下，血小板中miR-233表達(dá)顯著升高，并以MV的形式釋放到血漿中。腸炎、肝炎、腎炎和AS患者血漿中血小板MV(P-MVs)的miR-223水平顯著升高。血小板釋放的miR-233可通過靶向胰島素樣生長因子1受體促進(jìn)糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡［13］。

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷繼發(fā)遷移是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以作用于內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)其遷移。近期研究顯示單核細(xì)胞(THP-1)來源的MV可進(jìn)入人微血管內(nèi)皮細(xì)胞-1并釋放miR-150，miR-150水平的升高可有效地降低c-Myb蛋白的表達(dá)而增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。進(jìn)一步研究顯示，從AS患者血漿中分離出的MVs含有較高水平的miR-150，這些MVs比從健康人分離的MVs更能有效促進(jìn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞-1的遷移，提示分泌microRNA可以MV的形式進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)其凋亡、遷移，誘導(dǎo)AS的發(fā)生，促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生［14］。

3.1.2 促進(jìn)血管生成 血管生成存在于許多疾病的生理及病理發(fā)生過程中，如腫瘤、肥胖相關(guān)和AS性疾?。?6］。體外的毛細(xì)血管形成實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單核細(xì)胞分泌的含有miR-150的MV具有較強(qiáng)的促血管生成活性。AS患者血漿中升高的分泌型miR-150也可顯著促進(jìn)血管生成。通過MV形式給予荷瘤小鼠和ob/ob肥胖小鼠(瘦素缺陷型小鼠)miR-150的反義寡核苷酸，下調(diào)miR-150的表達(dá)可顯著降低小鼠血管生成，在一定程度上抑制了AS的發(fā)展［27］。提示MV分泌的miR-150可促進(jìn)血管生成，加速AS的發(fā)生，是心血管疾病潛在的治療靶點(diǎn)。

3.1.3 促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大 心肌細(xì)胞肥大引起心力衰竭，Bang等［28］將心肌成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，心肌成纖維細(xì)胞分泌的富含miR-21-3p(miR-21*)的MVs可進(jìn)入心肌細(xì)胞并誘使心肌細(xì)胞肥大。在血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌肥大的小鼠模型中，注入miR-21*抑制劑后發(fā)現(xiàn)肥大的心肌細(xì)胞病變明顯減少。提示MVs包裹的miR-21*可釋放進(jìn)入心肌細(xì)胞，并促進(jìn)心肌肥大，加速心血管疾病的發(fā)生。

3.2 心血管保護(hù)作用

3.2.1 抑制AS斑塊形成 Hergenreider等［29］對(duì)在內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞間通訊的miRNA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞中受Krupple樣生長因子2調(diào)節(jié)顯著升高的miR-143/145可進(jìn)入平滑肌細(xì)胞抑制其靶基因表達(dá);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，將內(nèi)皮細(xì)胞分泌的含有miR-143/145的微囊泡注入經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)且主動(dòng)脈ApoE基因缺陷(ApoE-/-)的小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，其AS斑塊形成明顯減緩。綜上所述，微囊泡介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間miRNA的傳遞在AS斑塊的形成中發(fā)揮重要作用。

3.2.2 抗細(xì)胞凋亡 在缺氧等造成的動(dòng)脈損傷的情況下，趨化因子12(CXCL12)可通過作用于其受體CXCR4招募骨髓中的祖細(xì)胞對(duì)血管進(jìn)行修復(fù)，促進(jìn)血管新生，抑制細(xì)胞凋亡。Zernecke等［12］發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)來源的凋亡小體可促血管平滑肌細(xì)胞、鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中趨化因子12(CXCL12)的產(chǎn)生;同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-126是HUVEC來源的凋亡小體中含量最豐富的miRNA，可通過靶向調(diào)節(jié)多種蛋白如G蛋白信號(hào)16，進(jìn)而調(diào)節(jié)CXCL12的表達(dá);當(dāng)給與AS模型小鼠凋亡小體或miR-126后發(fā)現(xiàn)，其可抑制AS斑塊的形成，提示內(nèi)皮細(xì)胞來源的凋亡小體包裹的miR-126具有抗細(xì)胞凋亡，抑制AS形成作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)對(duì)于缺血性心臟病的治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，其可通過分泌旁分泌因子保護(hù)缺血心肌。Feng等［30］研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理后MSC分泌的外泌體富含miR-22，并可作用于心肌細(xì)胞，減少其因缺血造成的細(xì)胞凋亡;miR-22對(duì)心肌細(xì)胞的抗凋亡作用主要通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)甲基-CpG結(jié)合蛋白2的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

3.2.3 抗炎作用 將內(nèi)皮細(xì)胞與運(yùn)載miR-223的HDL共孵育后發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-223顯著升高，而與miR-223缺陷的小鼠的HDL共孵育后內(nèi)皮細(xì)胞中miR-223含量無顯著變化，提示HDL運(yùn)載的miR-223可進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HDL運(yùn)載的miR-223可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞間黏附因子1的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而可延緩心血管疾病的發(fā)生［31］。

3.2.4 心肌保護(hù)作用 心臟祖細(xì)胞(Cardiac progenitors，CPC)可通過旁分泌功能介導(dǎo)心肌保護(hù)作用。Chen等［32］研究了CPC來源的外泌體對(duì)急性缺血再灌注造成的心肌損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)CPC外泌體中富含miR-451，且可被心肌細(xì)胞(H9C2)攝取，通過抑制caspase 3/7的激活保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激造成的損傷，提示富含miR-451的CPC外泌體是潛在的心肌保護(hù)因子。

4 結(jié) 語

循環(huán)miRNA是潛在的疾病標(biāo)志物已得到廣泛認(rèn)可，有關(guān)其穩(wěn)定存在的形式、與疾病相關(guān)的來源與功能的研究已成為當(dāng)前該領(lǐng)域研究的又一熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，心血管疾病患者血漿特異性的miRNA可來源于損傷的心肌細(xì)胞、凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞以及AS斑塊的破裂，并以MV包裹、HDL運(yùn)載和Ago2蛋白結(jié)合等多種方式穩(wěn)定的存在于血循環(huán)中，并被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞，既可通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、遷移，促進(jìn)血管生成和促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大而加速心血管疾病的發(fā)生，又可通過抑制斑塊形成、抗細(xì)胞凋亡、抗炎、保護(hù)心肌細(xì)胞而保護(hù)心血管，共同調(diào)節(jié)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。然而，盡管目前已取得了如上的一些進(jìn)展，但與心血管疾病相關(guān)的循環(huán)miRNA的來源、存在形式及功能的研究仍處于探索階段，其來源有待進(jìn)一步發(fā)掘，穩(wěn)定存在的不同形式與功能的關(guān)系尚不清楚，分泌miRNA對(duì)靶細(xì)胞的作用機(jī)制尚未完全闡明，其促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生和保護(hù)心血管作用哪種更占優(yōu)勢(shì)還有待證明［33］;且已有的研究大多集中在AS形成中對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，對(duì)心血管疾病的其他過程涉及較少，對(duì)AS行程中其他細(xì)胞的功能尚未可知;又如研究發(fā)現(xiàn)miR-122與核仁磷酸蛋白1(NPM1)共培養(yǎng)可保護(hù)miRNA免遭核酸酶的降解，但血液中是否存在miRNA-NPM1蛋白復(fù)合物還有待證實(shí)［34-35］?？傊?，進(jìn)一步探明心血管疾病相關(guān)的循環(huán)miRNA的來源、存在形式及功能將為心血管疾病的診斷，預(yù)后評(píng)估及治療提供新思路。

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