何 苗綜述，張 紅審校

0 引 言

體外循環(huán)(cardio pulmonary bypass，CPB)后肺損傷是心臟手術(shù)最常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重的表現(xiàn)為急性肺損傷(acute lung injury，ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydistress syndrome，ARDS)，同時(shí)由此導(dǎo)致的肺功能障礙也是體外循環(huán)患者死亡的主要原因之一［1-2］。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為缺血再灌注損傷及全身炎癥反應(yīng)(血液與管道的接觸、肝素-魚精蛋白及內(nèi)毒素生成等)可能是CPB肺損傷發(fā)生的重要原因，但其具體機(jī)制目前尚不十分清楚。近年來，細(xì)胞凋亡在CPB的發(fā)病機(jī)制中越來越受到重視，從凋亡的角度來研究CPB相關(guān)性肺損傷，有助于進(jìn)一步揭示其發(fā)病機(jī)制并通過細(xì)胞凋亡的調(diào)控為減輕CPB后肺損傷提供新的手段?，F(xiàn)將近年的相關(guān)研究綜述如下。

1 肺組織細(xì)胞凋亡

細(xì)胞調(diào)亡是由多種控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。與不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動的過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控，是適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程，又稱為細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)。細(xì)胞凋亡或PCD在細(xì)胞更新和受損細(xì)胞的清除中起著至關(guān)重要的作用，并在多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。細(xì)胞凋亡不足或凋亡過度均可引起機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的病理生理變化，細(xì)胞凋亡過度時(shí)則會導(dǎo)致過多的組織細(xì)胞壞死及相應(yīng)器官組織的功能障礙。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在CPB肺損傷模型中，支氣管上皮、肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞等處，出現(xiàn)凋亡樣改變，其凋亡率隨時(shí)間呈上升趨勢，提示細(xì)胞凋亡可能參與CPB肺損傷的過程［4］。研究證實(shí)，在大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(typeⅡ alveolar epithelial cells，AT-Ⅱ)的培養(yǎng)液中加入CPB患者術(shù)后血清，可導(dǎo)致AT-Ⅱ的凋亡率上升，DNA電泳可見明顯的DNA碎裂梯帶［5］。同時(shí) Aebert等［3］發(fā)現(xiàn)，CPB 后患者的血清可明顯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而患者CPB前、肺葉切除術(shù)患者及健康志愿者的血清未發(fā)現(xiàn)其促內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。因此，目前認(rèn)為CPB后肺組織細(xì)胞凋亡的主要是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，而這2種細(xì)胞在維持肺臟正常功能中起到重要的作用。

2 CPB肺組織細(xì)胞凋亡的誘因

多種因素參與誘導(dǎo)CPB肺組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其中氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷、全身炎癥反應(yīng)是其主要因素。以上因素并不直接引起細(xì)胞凋亡，而是通過一定的信號傳遞方式激活生存與死亡的相關(guān)基因，然后激活細(xì)胞執(zhí)行死亡。當(dāng)肺組織細(xì)胞過度凋亡時(shí)可導(dǎo)致CPB術(shù)后肺功能、生理、生化和組織學(xué)的改變，造成氣體交換障礙、肺力學(xué)的改變及肺水腫［6］。

2.1 氧化應(yīng)激反應(yīng) 在細(xì)胞凋亡的諸多誘因中氧化應(yīng)激，尤其是脂質(zhì)過氧化物與細(xì)胞凋亡的發(fā)生有密切關(guān)系［7］。正常情況下，機(jī)體內(nèi)氧化損傷和抗氧化能力處于動態(tài)平衡，而CPB可破壞此平衡，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［8］。CPB期間及術(shù)后，交感神經(jīng)系統(tǒng)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活可以導(dǎo)致全身氧化應(yīng)激增強(qiáng)而誘發(fā)和加重肺細(xì)胞凋亡。CPB時(shí)可通過NADPH氧化酶和NADH氧化酶的作用形成大量的氧自由基，氧自由基的產(chǎn)生和其它代謝產(chǎn)物所導(dǎo)致的氧化性應(yīng)激可以通過直接裂解DNA、氧化膜脂質(zhì)或上調(diào)凋亡相關(guān)調(diào)控基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。同時(shí)肺缺血期間肺缺氧以及再灌注即刻產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)可導(dǎo)致線粒體膜損傷和細(xì)胞色素C的釋放，啟動caspase介導(dǎo)的PCD或細(xì)胞凋亡［10］。再灌注損傷早期，ROS的產(chǎn)生增加也與炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子和黏附分子的上調(diào)有關(guān)，這些細(xì)胞因子可引起多形核中性粒細(xì)胞(polymorpho-nuclear leukocyte，PMN)的聚集，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、血栓形成、補(bǔ)體激活和細(xì)胞凋亡［10-11］。Klass等［6］在豬CPB模型中發(fā)現(xiàn)，CPB和心臟驟?？杉せ頡OS介導(dǎo)肺組織損傷和肺細(xì)胞凋亡;使用ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸后可明顯減少caspase-3陽性細(xì)胞的數(shù)量及羥基-2-脫氧鳥苷的水平，減少肺細(xì)胞凋亡，減輕CPB后肺損傷。硝基酪氨酸是機(jī)體氧化應(yīng)激的主要標(biāo)志之一，研究證實(shí)硝基酪氨酸的形成與血管功能障礙呈正相關(guān)，可能與CPB后肺組織細(xì)胞凋亡及肺功能障礙有關(guān)［6］。

2.2 肺缺血再灌注損傷(lung ischemia reperfusion injury，LIRI) 現(xiàn)已明確LIRI可誘導(dǎo)肺細(xì)胞凋亡［12-13］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在肺缺血再灌注組的大鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，而假手術(shù)組(僅開胸組)的大鼠肺組織中幾乎沒有凋亡細(xì)胞［14］。LIRI誘導(dǎo)肺細(xì)胞凋亡與肺的解剖特殊性有一定關(guān)系。肺有2組血液循環(huán)系統(tǒng)，包括肺循環(huán)及支氣管循環(huán)。正常情況下，支氣管動脈僅提供全肺約1% ～3%的血供;CPB期間，支氣管動脈能為肺提供部分血供，但分布不均。CPB期間阻斷段腔靜脈后肺動脈血供停止，此時(shí)肺得不到充分降溫，因此處于缺氧和相對高代謝狀態(tài)，易發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞損傷。在肺動脈恢復(fù)血供后，富含高張力氧的血液進(jìn)入肺，導(dǎo)致缺血再灌注損傷。其中，LIRI導(dǎo)致的Na+泵失活與Ca2+超載是引發(fā)肺組織細(xì)胞凋亡的重要因素［15］。CPB肺缺血過程中易導(dǎo)致Na+泵失活，再灌注后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，導(dǎo)致鈣超載。線粒體是細(xì)胞內(nèi)鈣超載攻擊的重要靶點(diǎn)，Ca2+依賴性蛋白酶被激活，破壞細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜的完整性，引起能量代謝障礙，膜通透性增加，線粒體內(nèi)膜和外膜間隙釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子，促進(jìn)細(xì)胞凋亡或壞死。

2.3 全身炎癥反應(yīng) Kirklin等［16］于20世紀(jì)80年代初首次提出CPB誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)的概念。CPB期間，血液與管道的接觸、缺血再灌注損傷、機(jī)血回輸、血液稀釋以及內(nèi)毒素等因素均可激活補(bǔ)體系統(tǒng)而介導(dǎo)全身炎性反應(yīng)［2，9］。CPB所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)是造成臟器血管內(nèi)皮功能紊亂和相關(guān)器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷的主要原因之一。CPB引起的炎性反應(yīng)可引發(fā)肺組織細(xì)胞凋亡，其中，PMN在肺內(nèi)的聚集、激活、凋亡延遲和細(xì)胞因子是導(dǎo)致CPB后肺組織細(xì)胞凋亡的重要因素［17］。

2.3.1 PMN的聚集、激活及凋亡延遲 CPB誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中，白細(xì)胞特別是PMN占據(jù)主要地位，它不僅具有化學(xué)趨化性，且反應(yīng)迅速［17］。PMN在肺內(nèi)聚集、激活及凋亡延遲是CPB后肺細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)，其機(jī)制與氧自由基的形成、炎癥介質(zhì)及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的釋放有關(guān)［18］?；罨腜MN可釋放超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等氧自由基，直接或間接損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，促發(fā)其凋亡。許多研究表明，主動脈開放后左-右房出現(xiàn)明顯的粒細(xì)胞數(shù)目差異，說明大量的PMN在肺內(nèi)聚集，這種現(xiàn)象與C5a誘導(dǎo)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的趨化及肺循環(huán)突然開放有關(guān)［19］。

2.3.2 細(xì)胞因子 細(xì)胞因子是由 、分泌的、能調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的小分子多肽。細(xì)胞因子可以在多種細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中與CPB肺細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的主要為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)及IL。而肺源性TNF-α的表達(dá)及釋放增加是誘導(dǎo)CPB后肺組織細(xì)胞凋亡的重要因素［20］。TNF-α可直接誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及間接調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能。通過支氣管或肺動脈灌注TNF-α抗體可有效降低肺組織細(xì)胞的凋亡指數(shù)，抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加［21］。TNF-α主要通過死亡受體途徑誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞凋亡，TNF-α與腫瘤壞死因子受體結(jié)合后，通過Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白使procaspase-8聚集，產(chǎn)生成熟的caspase-8，并激活下游的效應(yīng) caspase，致使細(xì)胞凋亡［22］。TNF-α 亦可激活線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡，但其分子機(jī)制尚不清楚［23］。

IL亦與CPB后肺細(xì)胞凋亡相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CPB后促炎性因子 IL-1、IL-6、IL-8的水平明顯增加［9］;通過上調(diào)抗炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，以及下調(diào)TNF-a和IL-8的水平，可有效抑制肺組織細(xì)胞凋亡，減輕肺損傷［24］。Fischer等［25］在 IL-10 的基因轉(zhuǎn)染模型中也證實(shí)，IL-10主要通過抑制凋亡方式改善LIRI，其機(jī)制可能是通過抑制炎癥和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。因此，促炎和抗炎細(xì)胞因子之間的平衡很大程度上決定了CPB后患者肺功能的狀態(tài)。

3 調(diào)控CPB肺細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

CPB肺細(xì)胞調(diào)亡涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控，但其確切的調(diào)控途徑尚無定論。目前認(rèn)為線粒體通路、死亡受體通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路參與這一過程。而CPB后肺組織細(xì)胞內(nèi)各種凋亡與抗凋亡分子之間的平衡狀態(tài)可能直接決定細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸和結(jié)局。以下分子機(jī)制為近年來CPB肺組織細(xì)胞凋亡的研究熱點(diǎn)。

3.1 Caspase家族 天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶是一類與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，分為起始型 Caspase和執(zhí)行型Caspase 2大類。起始型Caspase在凋亡信號的作用下被切割激活，激活的起始型 Caspase對執(zhí)行型Caspase進(jìn)行切割并使之激活，被激活的執(zhí)行型Caspase通過對靶蛋白的水解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase家族主要通過死亡受體通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可通過線粒體途徑導(dǎo)致DNA損傷致使凋亡的發(fā)生，同時(shí)caspase-12可協(xié)同其他應(yīng)激分子通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。Razi等［11］在大鼠LIRI模型中發(fā)現(xiàn)，減少caspase-2及caspase-3表達(dá)，可顯著增加血紅素加氧酶-1等抗氧化酶的生成，減少肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)量和炎癥因子的水平，降低肺細(xì)胞的凋亡指數(shù)，減輕LIRI。

3.2 Bcl-2家族 Bcl-2家族控制著線粒體外膜和內(nèi)膜的通透性，因此是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者，它們通過激活一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡的作用。Bcl-2家族主要分為2類:即抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W 等)及促凋亡蛋白(如 Bax、Bcl-Xs、Bak、Bid等)。其中 Bcl-2和 Bax是其代表性成員，與CPB相關(guān)性肺細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而Bcl-2/Bax比率直接決定了細(xì)胞的存亡。Bax與Bcl-2有較高的同源性，Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax與Bcl-2形成異源二聚體時(shí)則抑制細(xì)胞凋亡［26］。研究證實(shí)CPB期間，隨著肺組織細(xì)胞凋亡的上升，肺組織Bax蛋白表達(dá)增多，而Bcl-2表達(dá)明顯減少且Bcl-2/Bax降低，提示Bcl-2家族可能參與CPB肺組織細(xì)胞凋亡的過程［15，21］。目前認(rèn)為，Bcl-2的表達(dá)與Fas誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有某種程度的偶聯(lián)，Bcl-2可抑制或阻斷Fas介導(dǎo)的凋亡［21］。

3.3 Fas/FasL 死亡因子受體(Fas)/死亡因子配體(FasL)系統(tǒng)是死亡受體通路的經(jīng)典代表之一，在生理程序性細(xì)胞死亡中起著至關(guān)重要的作用，并與促炎癥反應(yīng)存在相互作用［27］。Fas屬于TNF受體/生長因子受體超家族，F(xiàn)asL是一種屬于 TNF家族的Ⅱ型膜蛋白，能與Fas結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體，介導(dǎo)以caspase-8為主的凋亡反應(yīng)，最終導(dǎo)致DNA斷裂，促使凋亡［28］。雖然表達(dá) Fas的細(xì)胞為多見，但表達(dá)FasL的細(xì)胞不多，因此肺組織細(xì)胞是否發(fā)生凋亡很大程度上取決于肺組織中是否有FasL的表達(dá)。研究顯示，F(xiàn)asL在正常兔肺組織中僅有輕微表達(dá)，而在CPB過程中表達(dá)明顯上調(diào)，提示Fas/FasL系統(tǒng)的活化可能參與CPB肺細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制［29］。

3.4 PI3K/Akt PI3K/Akt通路廣泛存在細(xì)胞中，參與細(xì)胞生長、增殖、分化及調(diào)節(jié)的過程。Akt處于該通路的中心環(huán)節(jié)，是PI3K的直接靶基因，是細(xì)胞生長、存活、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡的中介物，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子［30］。許多細(xì)胞因子、生長因子和物理刺激等都可通過激活PI3K而使Akt磷酸化，活化的Akt通過多種信號途徑影響下游一系列效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的生物學(xué)效應(yīng)。以下幾種機(jī)制可能與PI3K/Akt信號通路的抗細(xì)胞凋亡有關(guān):①使Bad磷酸化:活化的Akt可使Bad的Serl36磷酸化，與14-3-3蛋白結(jié)合、與Bcl-xL等解離，使其不能發(fā)揮促凋亡作用;同時(shí)穩(wěn)定線粒體膜電位，阻斷細(xì)胞色素C的釋放［31］。②使caspase磷酸化:活化的 Akt可使caspase-9的Serl96位點(diǎn)磷酸化而失去蛋白水解酶的活性，從而抑制其促凋亡作用。③抑制糖原合成酶3的活性，加速細(xì)胞凋亡;同時(shí)加快糖酵解的速度，使ATP的生成增加抑制細(xì)胞凋亡。④活化核轉(zhuǎn)錄因子 κB(nuclear factor κB ，NF-κB)，NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核后，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路與大鼠CPB后肺損傷有關(guān)，但其是否涉及調(diào)控CPB后肺組織細(xì)胞調(diào)亡的過程，尚需進(jìn)一步證實(shí)［32］。

除上述分子機(jī)制外，有絲分裂原活化的蛋白激酶超家族可能也參與CPB肺細(xì)胞凋亡的過程［13，32］。以上分子并不是獨(dú)立存在的，而是相互聯(lián)系、相互影響，構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控CPB肺組織細(xì)胞凋亡。雖然現(xiàn)已明確細(xì)胞凋亡參與了CPB肺損傷的過程，但其地位及機(jī)制尚有待明確。

4 結(jié) 語

綜上所述，肺組織細(xì)胞凋亡與CPB肺損傷有密切關(guān)系。目前，TNF-α抗體、氧自由基清除劑等在抗CPB肺細(xì)胞凋亡中取得突破性的進(jìn)展，因此深入研究CPB肺細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展及其分子調(diào)控機(jī)制、探尋其有效的干預(yù)方式，對減少CPB后肺部并發(fā)癥，提高患者的治愈率具有重要意義，并將為臨床CPB肺保護(hù)發(fā)現(xiàn)新的治療策略和方向。

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