韋秀望，易曉明，唐朝朋，徐振宇，梁建波，藍(lán)志相，周文泉

0 引 言

腎癌發(fā)生發(fā)展是多因素作用下的復(fù)雜過(guò)程，除基因重組、突變等傳統(tǒng)遺傳修飾之外，DNA異常甲基化和組蛋白修飾等同樣存在極大影響［1］。組蛋白甲基化酶(histone methylase SET domain containing 8，SET8)/賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶為含有SET結(jié)構(gòu)域的甲基化轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，是一個(gè)特異對(duì)組蛋白H4K20進(jìn)行單甲基化修飾的酶。SET8通過(guò)對(duì)組蛋白進(jìn)行 H4K20me1參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控［2］、異染色質(zhì)形成［3］、基因組穩(wěn)定［4］、細(xì)胞周期進(jìn)程及發(fā)育［5］等生物學(xué)過(guò)程。β-catenin定位于染色體3q21，是由CTNNB1基因編碼的連環(huán)蛋白家族成員。β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的第二信使，當(dāng)其從細(xì)胞膜移至細(xì)胞漿和細(xì)胞核時(shí)，將激活靶基因TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄，這被認(rèn)為是許多腫瘤中異常Wnt信號(hào)激活最為常見的形式。β-catenin異常的亞細(xì)胞定位及積聚與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［6-7］。本研究旨在運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)標(biāo)本及其相應(yīng)癌旁組織中SET8以及Wnt通路的重要信號(hào)分子β-catenin的表達(dá)情況，揭示SET8與Wnt信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)，并探討其在RCC中的作用機(jī)制及臨床意義，從分子生物水平探究組蛋白甲基化與腎癌發(fā)生發(fā)展之間存在的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010年至2012年廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院的RCC標(biāo)本50例。50例患者中男 33 例(66.7%)，女 17 例(33.3%);年齡27～78歲，平均年齡(56.4±14.61)歲，腫瘤直徑范圍2～12 cm，平均直徑4.3 cm。患者中無(wú)癥狀腎癌34例(68%)，有泌尿系統(tǒng)癥狀占 16例(32%)。按AJCC分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期(T1N0M0)12例、Ⅱ期(T2N0M0)16例、Ⅲ期(T1-T3N0-N1M0)14例、Ⅳ期(T0-T4N0-N1M0-M1)8例;高分化(G1)33例、中分化(G2)11例、低分化(G3)6例。選擇距腫瘤邊緣3 cm以外的相應(yīng)正常腎組織作為對(duì)照。全部患者術(shù)前均未接受化療、放療或其他抗癌治療。

1.2 試驗(yàn)方法 對(duì)每一例病理標(biāo)本連續(xù)4 μm切片3張，分別進(jìn)行HE染色和SET8免疫組化染色，抗SET8抗體稀釋濃度為1∶100，PBS代替一抗作替代對(duì)照。HE染色:新鮮組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋處理，切片機(jī)4 μm切片，HE染色。免疫組化染色(同時(shí)染色βcatenin):①4 μm石蠟切片，繼而二甲苯脫蠟，乙醇水化;②運(yùn)用高壓鍋高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻，水洗;③用PBS(pH7.4)漂洗;④滴加50μL一抗(兔抗人SET8單克隆抗體，工作效價(jià)為1∶100)，置入4℃冰箱過(guò)夜;⑤PBS沖洗;⑥滴加50 μL二抗(酶標(biāo)抗兔聚合物)，37℃孵育;⑦PBS沖洗，DAB顯色劑顯色;⑧自來(lái)水漂洗，蘇木精襯染及藍(lán)化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷:①光鏡下HE染色的病理診斷標(biāo)準(zhǔn):單盲法病理學(xué)復(fù)查，確定診斷為RCC，并進(jìn)行病理分級(jí)。②光鏡下SET8免疫組化標(biāo)記表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn):對(duì)染色陽(yáng)性反應(yīng)性強(qiáng)弱進(jìn)行打分。SET8免疫組化染色結(jié)果采用二級(jí)記分法:第1級(jí)計(jì)分方式:根據(jù)染色范圍記分，著色范圍以百分率進(jìn)行記分(400倍鏡下連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞)，≤1%計(jì)分為0分，1% ～20%計(jì)分為1分，20% ～50%計(jì)分為2分，＞50%計(jì)分為3分。第2級(jí)計(jì)分方式:著色程度，依據(jù)其深淺記分。無(wú)著色計(jì)分為0分，較淺著色計(jì)分為1分，較深著色計(jì)分為2分。將上述2項(xiàng)分值相加做為著色強(qiáng)度積分值:分值≤1.9分為陰性(-)，分值2.0～2.9分為弱陽(yáng)性(+)，分值3.0 ～3.9 分為陽(yáng)性(2+)，分值≥4分為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。以PBS代替一抗的陰性對(duì)照染色結(jié)果顯示無(wú)陽(yáng)性。③光鏡下β-catenin免疫組化標(biāo)記表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)按照Maruyamaeta et al方法，分別從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核判斷其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。細(xì)胞膜＞70%細(xì)胞陽(yáng)性為正常表達(dá)，反之為細(xì)胞膜表達(dá)缺失;細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核＞10%細(xì)胞陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)，即異位表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。運(yùn)用配對(duì)χ2檢驗(yàn)檢測(cè)組間陽(yáng)性表達(dá)率差異，運(yùn)用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色和SET8免疫組化染色結(jié)果

2.1.1 HE染色結(jié)果 50例RCC中，集合管癌5例伴轉(zhuǎn)移，腎透明細(xì)胞癌45例，其中8例存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。50例腫瘤相應(yīng)癌旁3 cm以外的腎組織均為正常腎組織。

2.1.2 SET8免疫組化染色結(jié)果 SET8在正常腎組織及RCC組織中的表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞膜及細(xì)胞核亦有表達(dá)，免疫組化顆粒狀呈棕黃色染色。50例RCC組織中，38例呈陽(yáng)性表達(dá)，12例呈陰性表達(dá)，其中8例伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌組織呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，1例伴隨遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌組織呈陰性表達(dá)，5例集合管癌伴轉(zhuǎn)移組織亦呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)陰性表達(dá)。此外，SET8在腎癌血管內(nèi)皮細(xì)胞中亦出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。SET8的表達(dá)陽(yáng)性率及其染色強(qiáng)度與患者年齡、性別、腫瘤直徑、組織學(xué)亞型及臨床表現(xiàn)無(wú)關(guān)(P＞0.05)，與病理分期、腫瘤細(xì)胞分級(jí)有關(guān)(P＜0.05)。見表 1，圖 1、圖 2。

2.2 β-catenin表達(dá)與RCC臨床及病理特征的關(guān)系 β-catenin在正常腎組織中的表達(dá)集中在腎小管、集合管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，免疫組化呈棕黃色網(wǎng)格狀分布，或于細(xì)胞間交界處染色，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核呈陰性表達(dá)。β-catenin的異常表達(dá)為細(xì)胞膜表達(dá)減弱或缺失，在RCC組織中出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)，即異位表達(dá)。β-catenin的異常表達(dá)與患者病理分期、腫瘤細(xì)胞分級(jí)有關(guān)(P＜0.05)。見表1，圖3、圖 4。

表1 SET8表達(dá)及其染色強(qiáng)度、β-catenin表達(dá)與RCC臨床及病理特征的關(guān)系(n)Table 1 Expression and staining intensity of SET8，expression of β-catenin，and their correlation with the clinical and pathological characteristics of renal cell carcinoma(n)

圖2 集合管癌組織中SET8的陽(yáng)性表達(dá)(Elivision×200)Figure 2 Expression of SET8 in the renal collecting duct carcinoma tissue(Elivision×200)

圖3 腎透明細(xì)胞癌組織中 β-catenin的陽(yáng)性異位表達(dá)(Elivision×200)Figure 3 Expression of β-catenin in the renal clear cell carcinoma tissue(Elivision×200)

圖4 集合管癌中β-catenin的陽(yáng)性異位表達(dá)(Elivision×200)Figure 4 Expression of β-catenin in the renal collecting duct carcinoma tissue(Elivision×200)

2.3 SET8與β-catenin蛋白的關(guān)系及在RCC與腎組織中表達(dá)的比較 SET8的表達(dá)與β-catenin蛋白異常表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.219，P=0.040)。RCC 與癌旁正常腎組織中SET8陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.214)。β-catenin蛋白異常表達(dá)率在RCC及癌旁正常腎組織中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。見表2。

表2 SET8和β-catenin蛋白在RCC及癌旁正常腎組織中的表達(dá)［n(%)］Table 2 Expressions of SET8 and β-catenin in the renal cell carcinoma and adjacent noncancerous tissues n(%)

3 討 論

SET8在腎組織的表達(dá)集中在腎小管細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中，在RCC組織的表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞膜及細(xì)胞核亦有表達(dá)［8］。病理分期及細(xì)胞分級(jí)越高、分化越差的RCC組織中SET8的陽(yáng)性率越高，染色強(qiáng)度也相應(yīng)顯著增強(qiáng)，提示在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中SET8扮演重要角色，印證了組蛋白甲基化與RCC發(fā)生發(fā)展之間的密切聯(lián)系。本研究中3例RCC伴轉(zhuǎn)移的標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SET8同樣出現(xiàn)大量表達(dá)，這與上述提到的相關(guān)研究提出的組蛋白單甲基化與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，SET8可能作為調(diào)控腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)的說(shuō)法相同。此外，SET8在腎癌血管內(nèi)皮細(xì)胞中亦出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，提示其在腫瘤血管生成過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。

β-catenin在正常腎組織中的表達(dá)集中在腎小管、集合管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，或于細(xì)胞間交界處染色，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核呈陰性表達(dá)。β-catenin的異常表達(dá)為細(xì)胞膜表達(dá)減弱或缺失，在RCC組織中出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)，即異位表達(dá)。和SET8類似，β-catenin的異常表達(dá)與之存在相當(dāng)大的一致性。

SET8可以特異的對(duì)含有R-W-z-K-X-F結(jié)構(gòu)(W代表一個(gè)芳香族氨基酸，z代表一個(gè)非酸性氨基酸，F(xiàn)代表一個(gè)大的疏水氨基酸，R代表精氨酸，K即被修飾的精氨酸)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行單甲基化修飾［9］。本研究給我們很多啟示，在Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，SET8作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活輔助因子對(duì)組蛋白進(jìn)行H4K20me-1修飾，調(diào)節(jié)染色體構(gòu)象，從而招募更多轉(zhuǎn)錄因子聚集，開啟下游基因轉(zhuǎn)錄［10-11］。SET8對(duì)β-catenin的調(diào)節(jié)以及在Wnt信號(hào)通路中是否存在SET8的新的底物，仍然懸而未決［12］。于此同時(shí)，當(dāng)SET8參與進(jìn)Wnt信號(hào)通路時(shí)，它是否會(huì)受到Wnt信號(hào)的調(diào)控同樣值得思考，即Wnt信號(hào)是否可以通過(guò)或繞過(guò)β-catenin對(duì)SET8進(jìn)行修飾，從而影響SET8的活性改變，進(jìn)而影響H4K20me-1的過(guò)程，最終對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展造成影響［13］。

Wnt信號(hào)通路的異常激活參與包括腎癌在內(nèi)的腫瘤發(fā)生發(fā)展已經(jīng)得到大量的研究驗(yàn)證［14-15］，對(duì)其機(jī)制的研究也取得了進(jìn)展，而本研究探討了SET8在RCC中表達(dá)，肯定了其與Wnt信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)性，并探討其在RCC中的作用機(jī)制及臨床意義。目前大量相關(guān)研究都還未揭示SET8對(duì)Wnt信號(hào)通路激活的具體機(jī)制［16］，但是本研究提供了一些證據(jù)表明SET8與激活Wnt信號(hào)通路的激活有著密切關(guān)聯(lián)，而且Wnt誘導(dǎo)的H4K20me-1是靶基因轉(zhuǎn)錄的激活性標(biāo)志，SET8激活的H4K20me-1調(diào)控著Wnt信號(hào)通路的激活與異?；顒?dòng)，進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞活動(dòng)，與RCC的發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在必然的密切聯(lián)系，并可能對(duì)腫瘤血管的生成產(chǎn)生重要影響。

［1］ Cairns P.Renal cell carcinoma［J］.Cancer Biomark，2010，9(1-6):461-473.

［2］ Congdon LM，Houston SI，Veerappan CS，et al.PR-Set7-mediated monomethylation of histone H4 lysine20 at specific genomic regions induces transcriptional repression［J］.J Cell Biochem，2010，110(3):609-619.

［3］ Tardat M，Brustel J，Kirsh O，et al.The histone H4 Lys 20 methyltransferase PR-Set7 regulates replication origins in mammalian cells［J］.Nat Cell Biol，2010，12(11):1086-1093.

［4］ Oda H，Okamoto I，Murphy N，et al.Monomethylation of histone H4-lysine 20 is involved in chromosome structure and stability and is essential for mouse development［J］.Mol Cell Biol，2009，29(8):2278-2295.

［5］ Wu S，Wang W，Kong X，et al.Dynamic regulation of the PRSet7 histone methyltransferase is required for normal cell cycle progression［J］.Genes Dev，2010，24(22):2531-2542.

［6］ Gong A，Huang S.FoxM1 and Wnt/β-catenin signaling in glioma stem cells［J］.Cancer Res，2012，72(22):5658-5662.

［7］ 董 杰，王龍信，唐朝朋，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β不敏感的樹突狀細(xì)胞疫苗對(duì)腎細(xì)胞癌荷瘤小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(5):455-459.

［8］ Beck DB，Oda H，Shen SS，et al.PR-Set7 and H4K20me1:at the crossroads of genome integrity，cell cycle，chromosome condensation，and transcription［J］.Genes Dev，2012，26(4):325-337.

［9］ Couture JF，Collazo E，Brunzelle JS，et al.Structural and functional analysis of SET8，a histone H4 Lys-20 methyltransferase［J］.Genes Dev，2005，19(12):1455-1465.

［10］ Li Z，Nie F，Wang S，et al.Histone H4 Lys 20 monomethylation by histone methylase SET8 mediates Wnt target gene activation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(8):3116-3123.

［11］ 唐朝朋，徐振宇，周文泉，等.加速康復(fù)外科在后腹腔鏡腎上腺切除術(shù)中的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(8):829-832.

［12］ Schotta G.H4K20 monomethylation faces the WNT［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(8):3097-3098.

［13］ Holland JD ，Klaus A，Garratt AN，et al.Wnt signaling in stem and cancer stem cells［J］.Curr Opin Cell Biol，2013，25(2):254-264.

［14］ Kawamoto K，Hirata H，Kikuno N，et al.DNA methylation and histone modifications cause silencing of Wnt antagonist gene in human renal cell carcinoma cell lines［J］.Int J Cancer，2008，123(3):535-542.

［15］ 易曉明，許 松，何昊瑋，等.15-氧代繡線菊內(nèi)酯對(duì)腎癌786-0細(xì)胞增殖的抑制作用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(12):1250-1253.

［16］ J?rgensen S，Schotta G，S?rensen CS，et al.Histone H4 lysine 20 methylation:key player in epigenetic regulation of genomic integrity［J］.Nucleic Acids Res，2013，41(5):2797-2806.