張澤敏，姚永明，閻 賀，吳彩風(fēng)，牛常英，譚慎興，唐勝建，楊彪炳

0 引 言

擴(kuò)張皮膚移植是整形以及修復(fù)重建外科領(lǐng)域中常用的一種技術(shù)手段，但對(duì)于大面積皮膚缺損的患者，僅靠傳統(tǒng)過(guò)度機(jī)械擴(kuò)張的方法來(lái)獲取大量皮膚組織易導(dǎo)致其缺血壞死。因此，如何更有效地提高擴(kuò)張皮膚中毛細(xì)血管的數(shù)量及其成活率顯得尤為重要。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織分離出來(lái)的多能干細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后，可以向骨、軟骨、脂肪等間充質(zhì)細(xì)胞甚至上皮細(xì)胞分化［1］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射ADSCs使擴(kuò)張皮膚中CD31和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)量增加，從而提高了擴(kuò)張皮膚的血管化程度和皮瓣成活率，為臨床實(shí)際應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康清潔型3月齡新西蘭大白兔，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(魯)20120005，體重2～2.5 kg，購(gòu)自濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度控制在20～25℃，濕度約50%，DMEM培養(yǎng)基(低糖)(美國(guó)HyClone有限公司);胎牛血清(美國(guó)HyClone有限公司);CK19、CD31、VEGF、鼠抗兔單克隆抗體、羊抗鼠IgG、Elisa試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)(中國(guó));Heraews二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó));DMIRE2型全自動(dòng)倒置相差顯微鏡(Leica，德國(guó));KA-1000型低速離心機(jī)(鄭州南北儀器設(shè)備公司);30mL皮膚軟組織擴(kuò)張器(上海威寧整形制品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分離、培養(yǎng)、傳代以及鑒定 在無(wú)菌條件下取兔腎周新鮮脂肪，放置于盛有PBS緩沖液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗，剔除肉眼可見的小血管、包膜以及多余組織，剪成糊狀，用0.1%Ⅰ型膠原酶消化，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，加入完全培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基)終止消化，室溫下(離心半徑8 cm，1200 r/min)離心10 min，棄上清，留貼壁細(xì)胞;用低糖DMEM培養(yǎng)液重懸并接種至培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中(37℃、5%CO2)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)特征。用免疫熒光細(xì)胞染色檢測(cè) ADSCs表面特異性標(biāo)記物 CD34、CD44、CD29及CD106的表達(dá)情況。

1.2.2 擴(kuò)張模型的建立 將20只兔隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。用3%戊巴比妥鈉(1.0mL/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉大白兔，取仰臥位，術(shù)區(qū)常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。于兔脊柱左側(cè)2 cm肋骨上設(shè)計(jì)一圓形擴(kuò)張區(qū)域，垂直于脊柱方向切長(zhǎng)約2 cm的切口，用血管鉗充分鈍性剝離至淺筋膜，在淺筋膜深層剝出一腔隙，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組于腔隙內(nèi)均置入一30 mL圓形硅橡膠軟組織皮膚擴(kuò)張器(植入之前檢查擴(kuò)張器完整性)，徹底止血。檢查完畢后，并向擴(kuò)張囊內(nèi)注入20 mL等滲鹽水，使之充盈，縫合皮膚切口。術(shù)后即刻和術(shù)后(1次/d，連續(xù)3 d)肌肉注射青霉素。將第3代ADSCs經(jīng)胰酶消化、分離，用無(wú)血清DMEM配制成濃度為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，于術(shù)后在實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張皮下(真皮層)多點(diǎn)均勻注射ADSCs懸液1 mL，同法對(duì)照組僅注射無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基1 mL。1周后傷口愈合拆線并開始注水，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均每3天注水1次(10 mL/次)，重復(fù)上述步驟，4周完成注水(120 mL)。

1.2.3 擴(kuò)張皮膚的組織學(xué)觀察 4周擴(kuò)張完成后，將擴(kuò)張最明顯的皮膚組織取下置于4%多聚甲醛中固定，行石蠟組織切片，HE染色，在200倍光鏡下觀察擴(kuò)張皮膚組織中血管斷面情況。

1.2.4 擴(kuò)張皮膚組織中CD31的免疫組化檢測(cè)及微血管密度檢測(cè) 將石蠟切片脫蠟至水，30%的H2O2浸泡，熱抗原修復(fù)，自然冷卻后用10%羊血清孵育，加入一抗并4℃過(guò)夜;滴加生物素化標(biāo)記的二抗，滴加SABC，DAB顯色;三蒸水充終止顯色，經(jīng)蘇木精輕度復(fù)染，PBS沖洗，用甘油封固。陰性對(duì)照用PBS代替一抗以排除假陽(yáng)性。同時(shí)對(duì)CD31標(biāo)記的微血管進(jìn)行計(jì)數(shù):先在低倍鏡(10×10)隨機(jī)找出10個(gè)微血管著色密度最高區(qū)域，在200倍鏡下計(jì)數(shù)著棕色的微血管，取其平均數(shù)即為微血管密度［2］。

1.2.5 擴(kuò)張皮膚組織中VEGF表達(dá) 取適量?jī)龃娴臄U(kuò)張皮膚組織標(biāo)本，PBS洗凈后用眼科剪將其剪碎，將液氮緩慢少量倒入并充分研磨組織使其勻漿，然后離心機(jī)(直徑3cm，10000r/min)離心15min，棄勻漿留上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，終止后在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下處讀取吸光值并輸出濃度值來(lái)檢測(cè)VEGF的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 原代ADSCs呈圓形、透亮，24 h后貼壁細(xì)胞充分伸展。7 d左右，細(xì)胞形成魚群樣聚集，并形成集落，彼此融合呈長(zhǎng)梭形分布。ADSCs特異性標(biāo)志物 CD29、CD44陽(yáng)性表達(dá)，而與造血系統(tǒng)有關(guān)的抗原CD106、CD34則呈陰性表達(dá)。見圖1。

圖1 兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察與鑒別Figure 1 Morphological observation and identification of the expanded white rabbit model and adipose derived mesenchymal stem cells

2.2 擴(kuò)張皮膚的組織學(xué)檢查 2組皮膚在擴(kuò)張后膠原纖維均呈疏松排列，其中部分膠原纖維發(fā)生斷裂;實(shí)驗(yàn)組中毛細(xì)血管斷面較對(duì)照組明顯增多。見圖2。

圖2 兔擴(kuò)張皮膚組織中毛細(xì)血管數(shù)量(HE×200)Figure 2 The number of capillaries in the skin tissue after expansion(HE×200)

2.3 擴(kuò)張皮膚中CD31及微血管密度檢測(cè) 免疫組化染色顯示:實(shí)驗(yàn)組CD31表達(dá)量明顯增加。實(shí)驗(yàn)組微血管密度［(10.70 ±1.89)個(gè)/視野］明顯高于對(duì)照組［(5.20 ±1.48)個(gè)/視野］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 兔擴(kuò)張皮膚組織中CD31的表達(dá)(免疫組化染色 ×400)Figure 3 The expression of CD31 in skin tissue after expansion(IHC×400)

2.4 VEGF在兔擴(kuò)張皮膚中的表達(dá) ELISA測(cè)得的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張皮膚組織VEGF的表達(dá)［(300.27±23.40)pg/mL］明顯高于對(duì)照組［(215.46 ±24.19)pg/mL］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

3 討 論

在擴(kuò)張皮瓣移植過(guò)程中，皮瓣成活率主要取決于其中毛細(xì)血管數(shù)量以及血液供應(yīng)情況。以往研究表明，毛細(xì)血管的新生主要依靠?jī)?nèi)皮祖細(xì)胞的分化、遷移以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、修復(fù)來(lái)完成［3-4］。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)張皮瓣由于受到牽拉、缺氧等刺激使其毛細(xì)血管的數(shù)量明顯高于普通皮瓣［5］。但Mc-Cann等［6］發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)張皮瓣面積大于原始面積50%時(shí)，擴(kuò)張皮瓣中毛細(xì)血管的數(shù)量會(huì)小于普通皮瓣中的數(shù)量。上述結(jié)果說(shuō)明不能單純僅靠機(jī)械應(yīng)力來(lái)獲取大量額外的皮膚組織。眾所周知，皮瓣的血管化程度與其移植后成活率密切相關(guān)，高度血管化的皮瓣移植可明顯提高其成活率;低血管化的皮瓣移植其壞死率會(huì)明顯增加。因此，尋找提高擴(kuò)張皮膚中血管化的方法尤為重要。

近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道了許多提高皮膚血管化的方法，Lee等［7］研究發(fā)現(xiàn)罌粟堿能增加擴(kuò)張皮膚血流量;欒杰等［8-9］也認(rèn)為通過(guò)外用罌粟堿霜?jiǎng)﹣?lái)作用于擴(kuò)張皮膚，對(duì)皮瓣微血管可以起到一定擴(kuò)張作用，并通過(guò)提高血流量來(lái)增加皮瓣的存活長(zhǎng)度。另外，二甲基亞砜［10］、類固醇類、茶堿類藥物［11］也被證實(shí)能夠加速組織血管化。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，干細(xì)胞技術(shù)目前正以其無(wú)可比擬的優(yōu)越性被應(yīng)用于多種臨床治療及研究中［12-13］，同其他干細(xì)胞相比，ADSCs具有來(lái)源豐富、易于獲得、免疫原低［14］、無(wú)不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又避免了許多倫理問(wèn)題，已逐步成發(fā)展成為種子細(xì)胞的新來(lái)源。

皮膚擴(kuò)張模型是典型的牽拉、缺血損傷性模型。研究表明，干細(xì)胞在外界牽拉刺激和VEGF的共同作用下可促進(jìn)其向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化［15-16］。在本次實(shí)驗(yàn)中免疫組化結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD31的表達(dá)量明顯增加，且微血管密度也明顯增大。這說(shuō)明ADSCs在皮膚組織擴(kuò)張過(guò)程中促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，其參與毛細(xì)血管管壁結(jié)構(gòu)的生成，微血管數(shù)量的增加進(jìn)而保證了擴(kuò)張皮膚更好的血液供應(yīng)，更好地為周圍新生組織提供更多的血液營(yíng)養(yǎng)支持以利于擴(kuò)張皮膚組織更好地生長(zhǎng);除此之外，脂肪干細(xì)胞還具有分泌功能［17-18］，可分泌多種與創(chuàng)面的愈合、血管的重建密切相關(guān)的因子，如VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。在這些因子當(dāng)中，VEGF被認(rèn)為是與血管新生最密切相關(guān)的細(xì)胞因子，可促進(jìn)內(nèi)皮系細(xì)胞的存活和血管新生［19-20］。因此，VEGF可通過(guò)植入的ADSCs分泌從而在擴(kuò)張皮膚再生過(guò)程發(fā)揮著一定的作用，通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化從而促進(jìn)新生血管形成。但目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚不能定論脂肪干細(xì)胞在擴(kuò)張皮膚中的轉(zhuǎn)歸以及其促進(jìn)擴(kuò)張皮膚中毛細(xì)血管增生的具體機(jī)制，它是否最終轉(zhuǎn)化為了血管內(nèi)皮細(xì)胞，仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，脂肪干細(xì)胞是一種非常有前景的種子細(xì)胞［21］，它在促進(jìn)擴(kuò)張皮膚組織血管化，降低擴(kuò)張皮瓣的壞死率方面具有重要的意義，為今后的臨床實(shí)際應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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