李新靈，張 冰，雷 鐘，杜 靖

0 引 言

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)即腎臟在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流，組織損傷進一步加重［1］，它是繼急性腎損傷、腎動脈狹窄、低血壓、心臟手術(shù)等許多疾病后出現(xiàn)的較為棘手的并發(fā)癥。有數(shù)據(jù)指出，心血管大手術(shù)、腎移植術(shù)等大手術(shù)后的急性腎損傷發(fā)生率達30%，死亡率高達60%，術(shù)中腎血流灌注不足而引起缺血再灌注損傷是其主要原因［2］，因此，RIRI已成為臨床麻醉面臨的一種常見的病理生理變化，受到廣泛關(guān)注。許多研究顯示，腎缺血再灌注損傷不僅限于損傷的局部組織，還會對遠隔器官造成影響，嚴重影響著疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后［3-7］。因此，預(yù)防腎缺血再灌注損傷及對遠隔器官的影響已成為臨床亟待解決的問題。

右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)是一種高選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，具有抗交感、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等作用，現(xiàn)已廣泛用于手術(shù)麻醉的輔助用藥及重癥監(jiān)護室患者的鎮(zhèn)靜。多項研究顯示，DEX可抑制炎癥因子的釋放，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有臟器保護功能［8-10］。在缺血再灌注損傷領(lǐng)域，許多研究者已在動物及臨床實驗中證實，DEX不僅可減輕缺血再灌注臟器的損傷程度，還可減輕遠隔器官的損傷，其機制可能與抑制心肌細胞凋亡和減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)［3-6，11］。有研究表明，急性腎損傷患者因心力衰竭的死亡率高于因呼吸衰竭、肝功能衰竭而引起死亡［12-13］。因此，本研究擬探討DEX對大鼠腎缺血再灌注不同時間心肌組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級Wistar雄性大鼠40只(由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重250～300 g，實驗動物合格證號:SCXK(新)2011-0003，DEX注射液(批號:09081232，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，Cr試劑盒、BUN試劑盒(中生北控生物科技股份)，IL-10試劑盒、TNF-α試劑盒(上海豐翔生物科技有限公司)，TGL-20M離心機(成都泰盟儀器公司)，顯微鏡(OLYMPUS公司)，MP-2002分析天平梅(特勒-托利多)，WD-2102A型自動酶標儀(北京六一儀器廠)，移液器(北京華力航科技發(fā)展有限公司)，手動組織勻漿器、超低溫冰箱由新疆醫(yī)科大學(xué)厚博學(xué)院提供，恒溫箱、切片機由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提供。

1.2 實驗方法 實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水，溫度:18～26℃，相對濕度:40% ～70%，通風(fēng)換氣:8～12次/h。將40只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組(n=8):假手術(shù)組，腎缺血60 min，腎缺血120 min組，DEX+腎缺血60 min組、DEX+腎缺血120 min組。

采用腹腔注射10%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉后鼠臺固定，沿腹白線開腹約5 cm，鈍性分離皮下組織與筋膜，暴露腹腔。假手術(shù)組游離雙側(cè)腎蒂，只穿線，不結(jié)扎。腎缺血60 min組暴露右腎及腎蒂，雙線結(jié)扎后切除右腎，再暴露左腎及腎蒂，分離腎包膜及左腎動脈，用一根絲線將開口一面朝上的塑料管和動脈固定好，可見左腎顏色由鮮紅變?yōu)榘导t，則腎缺血模型成功，缺血60 min后沿塑料管先前的切口剪開絲線，恢復(fù)動脈血供，若腎臟顏色逐漸由暗紅變成鮮紅色表明再灌注成功。腎缺血120 min組是缺血120 min后恢復(fù)組織血供，余操作與腎缺血60 min組相同。DEX+腎缺血60 min、120 min組于缺血前30 min腹腔注射DEX 50 μg/kg，余操作同腎缺血 60 min、120 min 組。假手術(shù)組和腎缺血60 min組及腎缺血120 min組均以等容量等滲鹽水替代DEX。

操作完成后動脈夾關(guān)閉腹腔，并于腹部覆蓋紗布，手術(shù)燈光照以保溫并計時。再灌注3 h時打開腹腔，腹主動脈采血2 mL，緩慢注入EP管，使用TGL-20 M離心機離心半徑:10 cm，4℃下3000 r/min，離心10 min后取上清，采用試劑盒測血中血清肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)含量。采集完血樣，斷頭處死大鼠，取左腎后將切口向大鼠頭端延長打開胸腔，取出心臟，將腎及心臟從中間剖開，冷磷酸鹽溶液沖洗干凈后，吸干表面水分，冰面上取左腎下極組織和左心室心尖部組織各3塊，大小為5 mm×5 mm，一塊置于10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察腎組織及心肌組織病理變化;另兩塊分析天平稱重后，以1∶9的比例加冷等滲鹽水，手動組織勻漿器制備組織勻漿后離心(條件同血液離心)，取上清液，采用ELISA法使用IL-10、TNF-α試劑盒，WD-2102A型自動酶標儀測定腎組織及心肌組織中炎癥因子水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，若方差齊則多組之間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊用秩和檢驗進行分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血清指標和腎、心肌組織細胞因子的比較與假手術(shù)組 Cr、BUN、腎組織 TNF-α、IL-10、心肌組織TNF-α、IL-10濃度比較，其他4組均升高(P＜0.05);與腎缺血60 min組上述指標比較，DEX+腎缺血60 min組、腎缺血120 min組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);DEX+腎缺血120 min組與腎缺血120 min組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、表2。

表1 大鼠腎組織和心肌組織中TNF-α和IL-10濃度的比較(±s，ng/L)Table 1 Comparison of TNF-α and IL-10 concentrations renal and myocardial tissues among different groups of rats(x ±s，ng/L)

表1 大鼠腎組織和心肌組織中TNF-α和IL-10濃度的比較(±s，ng/L)Table 1 Comparison of TNF-α and IL-10 concentrations renal and myocardial tissues among different groups of rats(x ±s，ng/L)

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與腎缺血60 min組比較，#P＜0.05;與腎缺血120 min組比較，△P＜0.05

組別 n 腎組織IL-10 TNF-α心肌組織IL-10 TNF-α假手術(shù)組 8 51.45 ±9.56 208.35 ±21.30 48.05 ±7.49 203.00±22.78腎缺血60 min 組 8 76.34 ±11.93* 335.37 ±12.38* 77.72 ±9.42* 329.92 ±19.32*DEX+腎缺血60 min 組 8 93.32 ±14.72* 269.35 ±31.76*# 93.93 ±11.49*# 262.99 ±33.04*#腎缺血120 min 組 8 97.40 ±14.96*# 578.45 ±30.59*# 105.20 ±13.62*# 565.00 ±37.66*#DEX+腎缺血120 min組 8 147.83±27.38＊△ 482.23±27.12＊△ 165.71±31.62＊△ 469.99 ±32.43＊△

表2 大鼠血清中Cr和BUN濃度的比較(±s)Table 2 Comparison of Cr and BUN concentrations among different groups of rats(±s)

表2 大鼠血清中Cr和BUN濃度的比較(±s)Table 2 Comparison of Cr and BUN concentrations among different groups of rats(±s)

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與腎缺血60 min組比較，#P＜0.05;與腎缺血120 min組比較，△P ＜0.05

組別 n Cr(μmol/L) BUN(mmol/L)假手術(shù)組8 53.20 ±9.21 3.75 ±0.78腎缺血60 min組 8 84.67 ±9.62* 8.55 ±1.08*DEX+腎缺血60 min組 8 69.67 ±9.52*# 7.56 ±0.70*#腎缺血120 min 組 8 167.11 ±18.81*# 13.42 ±1.25*#DEX+腎缺血120 min組 8 114.29±12.50＊△ 10.27±0.78＊△

2.2 顯微鏡下病理學(xué)改變

2.2.1 腎組織 假手術(shù)組:腎單位結(jié)構(gòu)正常，細胞形態(tài)未見明顯改變，染色均勻;腎缺血60 min組:腎小球毛細血管內(nèi)皮輕度增生，腎小球球囊腔輕度增寬，腎小管上皮輕度水腫、空泡變性;腎缺血120 min組:腎小管上皮顯著水腫，空泡變性，個別腎小管上皮細胞核消失，間質(zhì)血管增生、擴張充血;DEX+腎缺血60 min組:未見明顯異常;DEX+腎缺血120 min組:腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞輕度增生，腎小管上皮輕度水腫。見圖1。

2.2.2 心肌組織 假手術(shù)組:心肌細胞排列整齊，細胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，細胞質(zhì)染色均勻。腎缺血60 min組:心肌部分橫紋消失，肌漿溶解，胞漿嗜酸性變;腎缺血120 min組:心肌橫紋消失，肌漿溶解，細胞漿嗜酸性變，心肌細胞核消失，局灶凝固性壞死，核間距增寬，間質(zhì)水腫、結(jié)締組織增生，肌間血管擴張充血，纖維母細胞增生，慢性炎細胞浸潤;DEX+腎缺血60 min組:心肌局灶橫紋消失，灶區(qū)出血，細胞漿嗜酸性變，間質(zhì)少許炎性細胞浸潤;DEX+腎缺血120min組:心肌橫紋局灶消失，肌漿溶解，細胞漿灶區(qū)嗜酸性變，個別核消失，小灶區(qū)凝固性壞死。核間距輕度增寬，間質(zhì)輕度水腫，肌間血管擴張充血及出血，少許慢性炎細胞浸潤。見圖2。

圖2 鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化(HE×40)Figure 2 Morphological changes of the rat myocardial tissue under the microscope(HE×40)

3 討 論

RIRI是一個十分復(fù)雜的病理生理過程，涉及中性粒細胞浸潤、氧自由基產(chǎn)生、細胞凋亡、鈣超載，并有眾多炎癥介質(zhì)和免疫因子的參與，其中細胞凋亡和組織炎癥是主要病理變化，尤其炎癥反應(yīng)參與了組織損傷的全過程［1，14］。RIRI造成遠隔臟器心臟損傷機制尚不明確，推測可能機制為來源于腎臟的各種化學(xué)物質(zhì)包括氧自由基、細胞因子、黏附分子等大量進入體循環(huán)，致心臟微循環(huán)變化，影響心臟代謝和心功能［15］。

本研究采用右腎切除和左腎結(jié)扎后再灌注的方法制備腎缺血再灌注損傷模型［16］。通過檢測血清Cr、BUN含量及腎組織病理形態(tài)學(xué)改變驗證模型的制備。與假手術(shù)組大鼠比較，各組血清Cr、BUN含量升高，腎組織病理形態(tài)出現(xiàn)損傷，顯示腎功能嚴重受損，與報道一致［5，17］，說明 RIRI模型制備成功。

缺血時間長短是影響缺血再灌注損傷程度的主要原因之一。目前研究腎缺血再灌注損傷的模型采用的缺血時間從30～120 min長短不等。有研究顯示腎缺血30 min后再灌注，血漿Cr、BUN含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但病理損傷較輕微，而腎缺血超過120 min則組織發(fā)生不可逆性損傷［18］。周美君等［19］研究顯示，缺血再灌注損傷時，炎癥因子在再灌注3 h時表達升高。因此，本研究采用缺血60 min及120 min再灌注3 h制備大鼠腎缺血再灌注損傷模型，觀察不同缺血時間下炎癥因子的變化。

IL-10為具有代表性的內(nèi)源性抗炎因子之一［20］，可抑制TNF-α、IL-l、IL-8等前炎性細胞因子的產(chǎn)生，從而減輕組織炎癥。TNF-α是創(chuàng)傷或感染后機體發(fā)生炎癥反應(yīng)的始發(fā)因子，通過激活巨噬細胞激活I(lǐng)L-1、IL-6、IL-8 、TNF-α 、PGE2，并與其他細胞因子間相互誘生，協(xié)同擴大其生物學(xué)效應(yīng)，在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［21］。故本研究選擇上述兩指標反映腎臟缺血再灌注損傷對遠隔器官的炎癥反應(yīng)的影響。本研究結(jié)果顯示，大鼠腎缺血再灌注后，血清Cr、BUN含量升高，腎組織、心肌組織IL-10、TNF-α濃度升高，腎組織、心肌組織形態(tài)學(xué)出現(xiàn)損傷，提示大鼠腎缺血再灌注誘發(fā)心肌損傷，且其機制與炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，針對細胞因子進行的靶向治療可能對減輕腎缺血再灌注誘發(fā)遠隔器官損傷具有一定的作用。而結(jié)果還表明，隨著缺血時間延長，腎組織、心肌組織IL-10、TNF-α濃度越高，腎組織、心肌組織出現(xiàn)病理損傷加劇。

本研究根據(jù)張莉等［4］的實驗，于缺血前30 min腹腔注射 DEX50 μg/kg，分別檢測血清 Cr、BUN 含量，腎組織、心肌組織 IL-10、TNF-α濃度的變化，觀察腎組織、心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變，研究DEX對大鼠腎缺血再灌注心肌組織的影響及機制，以及這種影響是否會因缺血的時間不同而有差異。本研究結(jié)果顯示，給予缺血再灌注大鼠DEX后，與腎缺血60 min組、腎缺血120 min組對應(yīng)進行比較，大鼠血清中Cr、BUN濃度和腎組織、心肌組織中TNF-α濃度均降低，心肌組織中IL-10濃度升高，DEX+腎缺血120 min組腎組織IL-10濃度升高，腎臟及心肌組織病理學(xué)損傷明顯減輕，提示DEX可減輕大鼠腎缺血再灌注誘發(fā)的心肌損傷，其機制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)，且隨著缺血時間延長，DEX的保護作用并未下降，因此，結(jié)果對臨床用藥具有一定的指導(dǎo)作用。但由于本實驗僅對缺血時間劃分了2個時間段，因此，DEX與缺血時間的相關(guān)性還需進一步實驗。

DEX對大鼠腎缺血再灌注后腎組織及心肌組織的保護作用的機制還不是十分清楚，Wang等［22］發(fā)現(xiàn)DEX可能是通過“膽堿能抗炎通路”，作用于α2-腎上腺素受體，抑制交感神經(jīng)活性，致迷走神經(jīng)張力相對升高起到抗炎作用。斯妍娜等［24］研究指出DEX通過JAK2/STAT3信號通路，從而調(diào)控炎癥因子的水平，減輕組織炎癥反應(yīng)。Lai等［25］發(fā)現(xiàn)DEX可以抑制Toll樣受體4(TLR-4)介導(dǎo)的炎癥通路。Gu等［26］研究指出，DEX可以抑制TLR-4受體，繼而下調(diào)NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的活性，即TLR-4/NF-B/MAPKs作為完整通路發(fā)揮抗炎作用。Hofer等［27］則推斷 DEX 是通過下調(diào) NF-κB的活性，達到抑制炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，炎癥因子參與了腎缺血再灌注大鼠對遠隔器官心肌組織的影響;隨腎缺血時間延長，再灌注后腎組織及遠隔器官心肌組織病理損傷加重，炎癥因子水平升高;DEX可減輕大鼠腎缺血再灌注不同時間引起的遠隔器官心肌組織的損傷，其機制可能與抑制炎癥因子有關(guān)。

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