宋亞芹，付文博，盧 沐，劉 洋，魏育濤

0 引 言

微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的長度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，能夠識(shí)別特定的mRNA，并在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進(jìn)mRNA的降解或抑制翻譯過程而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用［1］。miRNA在物種進(jìn)化中具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性，其決定組織和細(xì)胞的功能特異性，在細(xì)胞生長發(fā)育過程的調(diào)節(jié)中起多種作用［2-3］。對(duì)miRNA的早期研究認(rèn)為，絕大多數(shù)人類miRNA基因都不成簇存在于基因組內(nèi)［1］，然而 Altuvia 等［4］通過對(duì) miRNAs基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，約37%的已知人類基因是成簇存在的［4］，這些基因簇在不同物種間具有較高的保守性，然而它們的生物學(xué)意義尚不完全清楚，不過已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一些miRNA基因簇在功能上比單個(gè)miRNA的作用更高效，多個(gè)成員同時(shí)作用能更加有效地行使其功能，保證生命活動(dòng)正常有序地進(jìn)行［5］。因此，對(duì)miRNA基因簇進(jìn)行相關(guān)研究，有利于深入了解其復(fù)雜的調(diào)控功能。

MiR-106b-25簇涉及腫瘤的增殖凋亡等生物學(xué)過程，其成員包括 miR-106b、miR-93和 miR-25，位于人類第7號(hào)染色體MCM-7基因的第13內(nèi)含子處［6］，雖然miR-106b-25簇以多順反子的形式被轉(zhuǎn)錄，但由于其種子序列不同，miR-106b-25簇分屬于2個(gè)不同的家族:miR-17家族和miR-25家族，前者種子序列為AAAGG，成員包括 miR-106b和 miR-93;后者種子序列為 AUUGCA，成員包括 miR-25?？蒲卸嘁詍iR-106b、miR-93及miR-25中一個(gè)為研究對(duì)象，鮮有以其三者同時(shí)作為目標(biāo)研究相關(guān)性。生物信息學(xué)是處理大量生物信息的新的研究手段，運(yùn)用生物學(xué)、數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)知識(shí)，利用多種數(shù)據(jù)庫，研究和分析生命體各種信息，近年來，生物信息學(xué)飛速發(fā)展，應(yīng)用其發(fā)現(xiàn)新基因并進(jìn)行功能研究成為熱點(diǎn)［7］。本研究旨在通過生物信息學(xué)的方法探索該基因簇所有成員的生物學(xué)功能，并進(jìn)一步分析其家族成員在調(diào)控生物學(xué)過程中的相互作用，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供線索與思路。

1 材料與方法

運(yùn)用在線靶基因預(yù)測軟件TargetScan6.1(http://www.targetscan.org/)，PicTar(http:pictar.mdc-berlin.de/)和 miRanda(http://www.microrna.org/)分別預(yù)測miR-106b、miR-93和miR-25的靶基因，分別取三者的交集，然后利用miRTarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.php)數(shù)據(jù)庫分別尋找這3個(gè)miRNA經(jīng)3種及3種以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過的靶基因，所得結(jié)果與前面的交集組成下一步分析的基因集合。分別將3個(gè)基因集合使用GeneOntology(http://geneontology.org/)［8-9］和 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)［10-11］數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物過程的功能富集分析和基于KEGG數(shù)據(jù)庫的信號(hào)通路富集分析，即得到基因集合在富集分析類別上的高頻率注釋以及有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和疾病通路。之后將3個(gè)基因集合匯總導(dǎo)入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)［12-13］，得到 3個(gè)miRNA靶基因編碼蛋白間的相互作用圖(PPI)。

GeneOntology進(jìn)行功能富集分析用到Fisher精確檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，通過多重比較檢驗(yàn)，確定功能富集的誤判率(false discovery rate，F(xiàn)DR)，完成功能富集分析。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析是對(duì)基因參與的所有信號(hào)通路進(jìn)行顯著性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分析，用到的分析方法同功能富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-106b-25簇的靶基因預(yù)測 TargetScan、PicTar及miRanda預(yù)測miR-106b的靶基因得到交集6個(gè)，結(jié)合miRTarbase中實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因8個(gè)，得到靶基因集合14個(gè);同法預(yù)測miR-93得到交集17個(gè)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證8個(gè)，得到靶基因集合25個(gè);預(yù)測miR-25得到交集28個(gè)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證16個(gè)，得到靶基因集合54 個(gè)，見表1。雖然TargetScan、PicTar、miRanda的預(yù)測方法不同，但均以保證miRNA與相應(yīng)靶基因的序列保守性為基礎(chǔ)，故所得交集靶基因與相應(yīng)miRNA結(jié)合具有較高的保守性。

表1 miR-106b-25簇的預(yù)測靶基因Table 1 Predicted target genes of the miR-106b-25 cluster

2.2 miR-106b-25簇的生物過程富集分析及KEGG通路分析 分別將miR-106b、miR-93、miR-25 3個(gè)基因集合作為靶基因集合通過GeneOntology(http://geneontology.org/)和 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物過程富集分析和基于KEGG數(shù)據(jù)庫的信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示3個(gè)miRNA的生物過程集中富集于:新陳代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖及投射等生物學(xué)過程，見表2。

表2 miR-106b-25簇的生物學(xué)過程富集分析Table 2 Biological process enrichment of the miR-106b-25 cluster

三者的pathway通路富集分析明顯集中于:膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、前列腺癌等腫瘤相關(guān)通路上，見表3。

2.3 靶基因編碼蛋白間的相互作用 將三者的靶基因集合匯總后通過STRING在線分析軟件(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，http://www.String-db.Org/)分析靶基因編碼蛋白間的相互作用并做出蛋白互作圖，見圖1。圖中顯示miR-106b-25簇3個(gè)成員靶基因編碼蛋白間具有復(fù)雜的相互作用，尤其是靶基因KAT2B、PTEN、TP53、CDH1、MDM2、E2F1、RB1、SMAD7 編碼蛋白在互作網(wǎng)絡(luò)中起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，而它們分屬于miR-106b-25簇的3個(gè)成員。

圖1 miR-106b-25簇的靶基因編碼蛋白互作圖Figure 1 Protein-protein interaction network of the miR-106b-25 cluster

3 討 論

有研究指出，對(duì)不同腫瘤中的miR-106b-25基因簇進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞發(fā)展周期明顯減慢，3個(gè)成員的表達(dá)效果雖然不同，但是趨勢相同，表明該基因簇的成員在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中起到一定作用［14］。我們的研究結(jié)果顯示，miR-106b-25簇3個(gè)成員靶基因集合的生物學(xué)過程明顯富集于細(xì)胞代謝過程及細(xì)胞分裂周期，而另有研究表明miR-106b-25簇參與了細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換，這一功能主要涉及RB通路［15］，在一些有關(guān)胃癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-93、miR-106b和miR-25通過調(diào)控細(xì)胞周期而影響細(xì)胞生長［16］，揭示了位于同一簇的miRNA在功能上的相關(guān)性。目前為止關(guān)于miR-93及miR-106b與細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換關(guān)系已有相關(guān)研究:miR-93可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞周期的 G1/S期轉(zhuǎn)換［17］;miR-106b可以提高E2F轉(zhuǎn)錄因子的活性來促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換，同時(shí)也促進(jìn)細(xì)胞增殖［18］。但有關(guān)miR-25與腫瘤細(xì)胞周期的研究還很少，這為下一步的課題提供了研究思路。既然miR-106b-25簇的成員間具有較強(qiáng)的功能相關(guān)性，我們猜測miR-25也參與促進(jìn)細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)換。

KEGG通路富集分析顯示miR-106b-25基因簇靶基因集中于各種腫瘤通路中，其成員編碼的下游靶蛋白中，處于核心位置的有E2F1、PTEN、SMAD7、CDH1、KAT2B、TP53、MDM2 及 RB1。而前 4 種蛋白與miR-106b-25基因簇的關(guān)系研究已有相關(guān)報(bào)道:miR-106b-25基因簇對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用可能主要通過轉(zhuǎn)化生長因子β而發(fā)揮，而在它們之間存在一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子E2F1，其對(duì)于兩者之間的關(guān)聯(lián)以及腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展具有很大影響［19-20］，同時(shí)E2F1上調(diào)還會(huì)促進(jìn)細(xì)胞周期中G1/S期的轉(zhuǎn)化，對(duì)腫瘤細(xì)胞的周期產(chǎn)生影響［21］;PTEN作為一種腫瘤抑制因子，有抑制細(xì)胞增殖的作用，這種腫瘤抑制蛋白受到miR-106b-25簇的抑制，并且這種抑制與miR-106b-25簇的成瘤性有關(guān)［22］。有研究顯示PTEN對(duì)細(xì)胞p13k/AKT通路具有重要影響，通過調(diào)控細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式阻止腫瘤細(xì)胞的生長，然而在前列腺癌和卵巢癌中miR-93可以靶向結(jié)合PTEN，降低PTEN表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲［23-25］;Smith 等［26］在對(duì)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Six1表達(dá)上調(diào)可激活miR-106b、miR-93和miR-25的表達(dá)，從而調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移過程，miR-93還可通過靶向調(diào)節(jié)SMAD7基因作用于TGF-β信號(hào)通路并引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移。CDH1是一種重要的細(xì)胞黏附分子，參與細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞遷移，在多數(shù)癌組織的細(xì)胞表面都存在CDH1的減少或消失，以致癌細(xì)胞黏附力減弱從而易從瘤塊脫落，成為侵襲與轉(zhuǎn)移的前提，Xu等［27］研究發(fā)現(xiàn)miR-25通過調(diào)控下游靶蛋白CDH1促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。上述報(bào)道中的因子與我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測出來的靶基因中處于核心地位的靶基因吻合，提示我們生物信息學(xué)分析的結(jié)果與后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)果具有一定的一致性，但目前關(guān)于KAT2B、TP53、MDM2、RB1與miR-106b-25簇的研究還很有限，需要我們進(jìn)一步驗(yàn)證。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不可能經(jīng)由單個(gè)蛋白而實(shí)現(xiàn)，通過蛋白互作圖可看出各種靶蛋白之間存在復(fù)雜的相互作用，據(jù)此可推測miR-106b-25簇中的3個(gè)成員相互作用，通過調(diào)控細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換參與腫瘤通路過程進(jìn)而調(diào)節(jié)多種下游靶蛋白促進(jìn)或是抑制腫瘤的發(fā)生，尤其是處于核心地位的 E2F1、PTEN、SMAD7、CDH1、KAT2B、TP53、MDM2 及 RB1，后5 種蛋白更是急需實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。這一結(jié)果提高了我們針對(duì)miRNA的研究效率，不僅為預(yù)測基因提供了重要信息，還為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供了研究目標(biāo)。

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