金 立，易 俊，何貞月，宋海珠

0 引 言

食管癌是八大常見腫瘤之一［1］，其發(fā)病率居我國(guó)惡性腫瘤的第4位，病死率居全部惡性腫瘤的第6位［2］，有2種病理類型:鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱鱗癌)和腺癌［3-4］。在東南亞地區(qū)，超過90%的食管癌為鱗狀細(xì)胞癌，食管鱗癌也是東亞地區(qū)最致命的腫瘤之一［5-6］。

人矮小同源盒基因2(short stature homobox 2，SHOX2)是同源異型家族的一個(gè)組成成員，約10000bp左右，位于人3號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，共包含10個(gè)CpG島［7］。SHOX2基因在胚胎時(shí)期表達(dá)于中胚層和外胚層，對(duì)骨骼、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用［8］。近年來一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)SHOX2基因的表達(dá)變化與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。在非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中，SHOX2高表達(dá)可能預(yù)示患者預(yù)后不良［9-10］。而在胃癌中，SHOX2高表達(dá)可能是由于STAT3激活所致［11］。隨著研究的深入，SHOX2在多種腫瘤中的致癌作用機(jī)制已逐漸闡明，但在食管鱗癌方面，SHOX2的作用仍不清楚。

本研究采用軟件預(yù)測(cè)，熒光素酶活性分析，通過轉(zhuǎn)染mimics和inhibitor于食管鱗癌細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)等方法證實(shí)miR-375在食管鱗癌細(xì)胞EC9706中靶向調(diào)控SHOX2基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究SHOX2基因在食管鱗癌中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人食管鱗癌細(xì)胞EC9706，人正常食管上皮細(xì)胞購(gòu)自上海復(fù)旦細(xì)胞庫(kù);人食管鱗癌組織，為我院心胸外科手術(shù)后病理保存標(biāo)本。感受態(tài)大腸埃希菌 DH5α，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，miR-375 mimics購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司;質(zhì)粒 pmiR，pSHOX2-375-WT，pSHOX2-375-mut由上海吉瑪公司合成;雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司;XhoⅠ酶、NotⅠ酶購(gòu)自Fermentas公司;凝膠回收試劑盒購(gòu)自BioFlux公司;DNA ligation kit購(gòu)自TOYOBO公司;PCR試劑盒購(gòu)于 abm公司;用于Western blot的抗體均購(gòu)于abcam公司。

1.2 預(yù)測(cè)miR-375和SHOX2基因的可能作用位點(diǎn) 運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件TargetScan、miRanda、PicTar、miRTarget2和PITA按照軟件操作流程預(yù)測(cè)miR-375和SHOX2基因可能的作用位點(diǎn)。

1.3 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SHOX2基因表達(dá)的靶向調(diào)控

1.3.1 SHOX2基因3'UTR區(qū)克隆及報(bào)告基因系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)所提取的總RNA濃度。取總RNA，用RT-PCR試劑盒(abm)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR引物由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成:SHOX2 F(SacⅠ):ATGAGCTCATTTCCCCCTCTCTATC;SHOX2 R(HindⅢ):ATAAGCTTCAAAGCTCAACCGCATAC。運(yùn)用 2×Taq PCR MasterMix(abm)20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:2×MasterMix 12μL ，cDNA 2μL，上游引物0.6 μL ，下游引物0.6 μL，ddH2O 4.8 μL，95 ℃ 變性 5 min，開始1個(gè)循環(huán)，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物回收，分別用XhoⅠ、NotⅠ雙酶切處理，然后與經(jīng)雙酶切處理后的載體連接，構(gòu)建成突變Vector 2個(gè)重組質(zhì)粒載體，分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與Luciferase實(shí)驗(yàn)步驟 共有3個(gè)質(zhì)粒，分別是:pmiR，pSHOX2-375-WT，pSHOX2-375-mut;2個(gè)micro-RNA，分別是miR-375，miR-NC。分為7組:pmiR組，pSHOX2-375-WT組，pSHOX2-375-WT+miR-375組，pSHOX2-375-WT+miR-NC組，pSHOX2-375-mut組，pSHOX2-375-mut+miR-375組，pSHOX2-375-mut+miR-NC組。

將Roche X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent，質(zhì)粒，miR-375 和 serum-free DMEM medium放置于室溫中，于平行的7個(gè)EP管中分別加入300μL的serum-free DMEM medium，分別加入每組質(zhì)粒和miR，混勻。在7個(gè)EP管中分別加入18 μL DNA:Transfection Reagent(1∶2)，混勻。用掌上離心機(jī)瞬時(shí)離心，靜置20min。將1mL 0.25%Trypsin 0.05%EDTA細(xì)胞消化液均勻滴加在EC9706細(xì)胞表面。37℃放置1 min后，加入5 mL含有10%FBS的DMEM終止消化。離心，取出上清，加入8 mL含有20%FBS的DMEM，計(jì)數(shù)。

輕輕加入300 μL細(xì)胞懸液于7個(gè)EP管中，每孔加入100 μL細(xì)胞和轉(zhuǎn)染復(fù)合物的混合液。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用檢測(cè)試劑盒Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega cat.no.E2920)。將 1 瓶Dual-Glo Luciferase Buffer加入到裝有Dual-Glo Luciferase Substrate的瓶子中，每孔加入75 μL Dual-Glo Luciferase Reagent，震蕩混勻，靜置15min，讀板。重復(fù)讀板3次。加入2.4 mL Dual-Glo Stop＆Glo Buffer，然后加入24 μL的 Dual-Glo Stop ＆ Glo Substrate(Dual-Glo Stop＆Glo Substrate:Dual-Glo Stop＆Glo Buffer=1:100)得到Dual-Glo Stop＆Glo Reagent，混勻。取 96孔板，每孔加入 75 μL Dual-Glo Stop ＆ Glo Reagent，震蕩混勻，靜置 15 min，重復(fù)讀板3次，導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 RNA提取和qPCR分析 總RNA通過Trizol試劑提取，提取過程遵循試劑說明書進(jìn)行。提取后的總RNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA保存于-20℃，用于后續(xù)qPCR。SHOX2和miR-375的相對(duì)表達(dá)量通過STEP ONE RT-PCR儀器以SYBR Green法，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行熒光采集分析。

1.3.4 Western blot檢測(cè) 總蛋白通過 RIPA裂解液獲得，并保存于-20℃溫度下。凝膠電泳使用10%的SDS電泳液、濕轉(zhuǎn)液將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后經(jīng)過5%的脫脂牛奶室溫下封閉2 h，加SHOX2抗體 4℃孵育過夜，熒光兔抗標(biāo)記，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行曝光分析。

1.3.5 細(xì)胞免疫組化染色 將9706細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，5 d后4%多聚甲醛固定，空氣干燥，0.5%Triton X-100 孵育 20 min，3%H2O2孵育15 min，封閉血清孵育20 min。一抗孵育4℃過夜，二抗37℃孵育30 min。DAB避光顯色，蘇木精復(fù)染，樹膠封固。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差(One-Way ANOVA)分析，組間兩兩比較方差齊同采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，方差不齊時(shí)采用Tamhane's T2檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件TargetScan、miRanda、PicTar、miRTarget2 和 PITA 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示:miRNA-375在SHOX2 3'UTR1156-1170 bp間有且僅有1個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)。見圖1。

2.2 質(zhì)粒測(cè)序 pSHOX2-375-WT Vector，pSHOX2-375-mut Vector重組質(zhì)粒測(cè)序顯示:克隆到pmiR載體上的序列與目標(biāo)序列完全一致，不存在點(diǎn)突變。見圖2。

2.3 熒光素酶活性分析 Luciferase測(cè)定結(jié)果顯示:pSHOX2-375-WT+miR-375組熒光素酶活性(0.261±0.036)顯著低于其余 6組［pmiR 組(1.818 ± 0.061)、pSHOX2-375-WT 組(1.820 ±0.086)、pSHOX2-375-WT+miR-NC 組(1.851 ±0.094)、pSHOX2-375-mut組 (1.861 ± 0.059)、pSHOX2-375-mut+miR-375 組(1.896 ±0.048)和pSHOX2-375-mut+miR-NC 組(1.760 ±0.062)］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而其余6組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)及miR-375結(jié)合SHOX2 3'UTR位點(diǎn)Figure 1 Target of prediction and miR-375 in combination with the SHOX2 3'UTR site

圖2 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果Figure 2 Sequence of the recombinant plasmid

2.4 qPCR分析與Western blot檢測(cè) 轉(zhuǎn)染miR-375于食管鱗癌細(xì)胞EC9706后，SHOX2 mRNA和蛋白表達(dá)量低于轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞(P＜0.05)。見圖3。

圖3 過表達(dá)miR-375后SHOX2 mRNA和蛋白表達(dá)Figure 3 Expressions of SHOX2 mRNA and protein when miR-375 was overexpressed in the EC9706 cells

2.5 細(xì)胞免疫組化染色 轉(zhuǎn)染miR-375于EC9706細(xì)胞后行細(xì)胞免疫組化染色分析。過表達(dá)miR-375組SHOX2表達(dá)呈陰性;而轉(zhuǎn)染 miR-NC細(xì)胞的SHOX2表達(dá)呈陽(yáng)性。見圖4。

圖4 鏡下觀察EC9706細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-375后SHOX2細(xì)胞染色結(jié)果(免疫組化染色 ×200)Figure 4 Microscopic observation of SHOX2 when miR-375 was overexpressed in the EC9706 cells(IHC×200)

2.6 組織病理標(biāo)本檢測(cè) 分析2例人體食管鱗癌術(shù)后病理標(biāo)本的miR-375與SHOX2檢測(cè)。食管鱗癌組織中的miR-375較癌旁組織相比表達(dá)降低，而SHOX2表達(dá)較癌旁組織表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)。見圖5。

圖5 食管鱗癌組織和癌旁組織標(biāo)本中的mRNA和蛋白表達(dá)情況Figure 5 SHOX2 mRNA and protein expressions in the esophageal squamous carcinoma tissues and normal esophageal tissues

3 討 論

食管癌根治主要依靠外科手術(shù)［6，12］，但其早期診斷率不高，往往直到腫瘤進(jìn)展到晚期階段才被確診［13-14］，從而失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而食管鱗癌對(duì)于化療的敏感性不高，因此積極尋找食管鱗癌的早期診斷方法，對(duì)于提高食管鱗癌的整體治愈率具有特殊的重要性和緊迫性［15-20］。

最近的研究顯示，miR-375表達(dá)下調(diào)與非小細(xì)胞肺癌的增殖和活躍程度相關(guān)［19］，而高表達(dá)miR-375的小細(xì)胞肺癌患者則提示可能預(yù)后較差和生存期較短［21］。在婦科腫瘤方面，miR-375在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌中表達(dá)水平的降低，被視為預(yù)后不良的標(biāo)志［22］。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-375可抑制胃癌細(xì)胞的體外侵襲和轉(zhuǎn)移能力，miR-375同樣可抑制原發(fā)性肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［23］。之前有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-375在食管腺癌的患者中表達(dá)水平降低［24］，但是miR-375能否對(duì)下游SHOX2基因表達(dá)進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)，以及其在食管鱗癌中的作用及分子機(jī)制未見報(bào)道。

SHOX2是SHOX的同源基因，是同源異型家族的一個(gè)成員，位于人3號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，約10000 bp［7］，有SHOX2a、SHOX2b、SHOX2c 3個(gè)亞型。主要功能為在脊椎動(dòng)物的胚胎形成時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。大量研究報(bào)道SHOX2的表達(dá)改變會(huì)影響早期的骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，而SHOX2甲基化則在多種腫瘤發(fā)生早期可以起到預(yù)測(cè)作用［25］。在肝癌發(fā)生過程中，SHOX2的高表達(dá)將增強(qiáng)體外肝癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力，過表達(dá)的SHOX2會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制SHOX2表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)也相應(yīng)收到抑制［26］。在一些未被確診為肺癌，卻早期出現(xiàn)的胸膜滲出的病例，SHOX2出現(xiàn)高表達(dá)的情況下，隨后都被確診為肺癌。這提示SHOX2的高表達(dá)或許能作為肺癌胸膜腔滲出的指示性標(biāo)志物［27］。雖然大量的研究證實(shí)SHOX2可視為多種腫瘤的致癌基因，但是其在食管鱗癌的具體調(diào)控機(jī)制仍不明確。

我們運(yùn)用5個(gè)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件TargetScan、miRanda、PicTar、miRTarget2 和 PITA 對(duì) miR-375 在SHOX2上可能的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示:miRNA-375在SHOX2 3'UTR1156-1170 bp間有且僅有1個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)。我們將此位點(diǎn)進(jìn)行基因突變處理，體外細(xì)胞熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miRNA-375對(duì)突變前后SHOX2基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:SHOX2野生型與miR-375結(jié)合后螢光素酶活性顯著低于其他處理組和對(duì)照組，提示miRNA-375對(duì)SHOX2基因有抑制作用。隨后我們轉(zhuǎn)染miR-375的mimics于EC9706并分別測(cè)定SHOX的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示miR-375過表達(dá)后EC9706的SHOX2 mRNA和蛋白表達(dá)水平都受到抑制，這可能預(yù)示食管鱗癌細(xì)胞中，SHOX2為受miR-375調(diào)控的下游靶基因，miR-375可以靶向負(fù)調(diào)控SHOX2基因的表達(dá);隨后細(xì)胞免疫組化染色過表達(dá) miR-375，EC9706細(xì)胞SHOX2表達(dá)呈陰性提示:SHOX2表達(dá)可能與miR-375表達(dá)相關(guān)。提示食管鱗癌組織中SHOX2的表達(dá)增強(qiáng)可能與miR-375的表達(dá)改變相關(guān)。最后，人體食管鱗癌術(shù)后病理標(biāo)本的miR-375與SHOX2檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn):高表達(dá)的miR-375癌旁組織中，SHOX2表達(dá)要顯著低于食管鱗癌組織中的SHOX2表達(dá)。上述結(jié)果提示:SHOX2的表達(dá)受miR-375調(diào)控，并且食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展可能是由于miR-375以及SHOX2表達(dá)水平改變參與調(diào)控等一系列結(jié)果所致。

本研究采用生物學(xué)預(yù)測(cè)及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)的方法，初步證實(shí)了在食管鱗癌，miRNA-375可以靶向負(fù)調(diào)控SHOX2基因的表達(dá)。

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