楊麗娟，周伯如，戴佳軒，周惠芳

0 引 言

補腎助孕方是國醫(yī)大師、白求恩獎?wù)芦@得者、南京中醫(yī)藥大學夏桂成教授根據(jù)數(shù)十年臨床應用總結(jié)得出的有效方劑，該方對黃體功能不全(luteal phase defect，LPD)所致的不孕癥、月經(jīng)不調(diào)、流產(chǎn)等均具有良好的治療效果。本研究用米非司酮構(gòu)建LPD大鼠模型［1］，用補腎助孕方進行干預，通過比較大鼠性腺軸中的下丘腦-垂體-卵巢-子宮部位的形態(tài)學變化，來探討補腎助孕方對LPD大鼠模型性腺軸各部位形態(tài)結(jié)構(gòu)的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級雌性 SD大鼠40只，8周齡，體重(200±20)g，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SCXK(滬)2012-0006，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF環(huán)境，分籠飼養(yǎng)，實驗期間大鼠自由攝食、飲水，室內(nèi)溫度控制在22～25℃，相對濕度約40% ～70%，各12 h的光照和黑暗交替進行，保持安靜飼養(yǎng)環(huán)境。補腎助孕方由淮山藥15 g、山茱萸10 g、炒白芍10 g、醋炒柴胡6 g、菟絲子15 g、鹿角片10 g等中藥組成，中藥飲片購自南京中醫(yī)藥大學百草堂，采用傳統(tǒng)水煎濃縮至每mL含生藥2 g，4℃保存?zhèn)溆?。米非司?上海新華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，25 mg/片，批號:060702)配置成濃度為1 mg/mL的均一混懸液，4℃保存?zhèn)溆?，給藥前復溫至25～28℃。HE染色試劑4%甲醛、電鏡染色試劑，4%的戊二醛，均由南京中醫(yī)藥大學病理教研室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及給藥 將大鼠分為空白組、模型組以及中藥低、高劑量組共4組，每組10只，空白組給予等滲鹽水1mL/100g，模型組給予米非司酮1mL/100g，中藥低、高劑量組分別予中藥 0.4、1.2 mL/100 g。每天陰道涂片，發(fā)現(xiàn)動情期即確定為D1，開始給藥，重復2個性周期。在周期結(jié)束當天16∶00統(tǒng)一處死［2-3］。以上2種藥液均按《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》換算［4］。實驗過程中中藥低劑量組死亡1只，中藥高劑量組死亡2只，原因可能為灌胃操作不當所致。

1.2.2 標本取材方法 10%水合氯醛按 0.35 mL/100 g行腹腔麻醉，麻醉成功后采血，斷頭處死后迅速取出下丘腦及垂體，肉眼及解剖顯微鏡下觀察下丘腦、垂體、卵巢及子宮形態(tài)，濾紙吸凈血液后，電子天平稱重。標本用4%多聚甲醛固定，常溫放置，行HE染色病理檢查，各組隨機選3只大鼠的垂體行透射電鏡檢查，先預冷器械，在冰上操作，用刀片將垂體前葉修成1 mm×2 mm×1 mm大小，做好標記，各組所取位置一致，立即量入4%戊二醛固定，4℃保存?zhèn)錅y電鏡。

1.2.3 測量指標 大鼠處死后取下丘腦、垂體、子宮、卵巢，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚5 μm)及常規(guī)HE染色，奧林巴斯BX40光學顯微鏡觀察下丘腦、垂體、卵巢及子宮組織形態(tài)學改變，并采用體視學計數(shù)卵巢中卵泡數(shù)及黃體數(shù)。其中每組各選3只大鼠，透射電鏡觀察下丘腦及垂體性腺細胞中的超微結(jié)構(gòu)及細胞器的改變。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示。當數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊性的條件下，各組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 下丘腦的形態(tài)學改變

2.1.1 下丘腦肉眼觀 將腦區(qū)分離翻轉(zhuǎn)底部，以灰結(jié)節(jié)和視交叉之間的中心點做為中心確定下丘腦組織，前界為視交叉前緣，后界為乳頭體后緣，兩側(cè)為顳側(cè)溝，整個下丘腦長、寬約4mm，深約2mm。各組間下丘腦形態(tài)外觀未見明顯差異。

2.1.2 下丘腦HE染色光鏡檢查結(jié)果 各組下丘腦細胞大小一致，形態(tài)規(guī)則，細胞間界限清楚，細胞質(zhì)少，神經(jīng)細胞無變性、壞死，膠質(zhì)細胞無增生。見圖1。

2.1.3 透射電鏡觀察下丘腦細胞形態(tài) 空白組可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及發(fā)達的高爾基復合體，核膜完整，有豐富的分泌顆粒和溶酶體;模型組中線粒體嵴斷裂空泡化;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，并形成髓樣小體，核不規(guī)則，核膜溶解，可見少量的分泌顆粒。中藥低、高劑量組核膜部分溶解，以低劑量組更為明顯，核旁高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，無明顯腫脹，可見少量的分泌顆粒。見圖2。

圖1 光鏡下觀察大鼠下丘腦細胞形態(tài)(HE×200)Figure 1 Morphology of the hypothalamus cells in different groups of rats observed under the light microscope(HE×200)

圖2 透射電鏡觀察大鼠下丘腦細胞形態(tài)(×2000)Figure 2 Morphology of the hypothalamus cells in different groups of rats observed under the transmission electron microscope(×2000)

2.2 垂體的形態(tài)學改變

2.2.1 垂體的肉眼觀 神經(jīng)垂體和腺垂體界限明顯，神經(jīng)垂體位于腺垂體中間部分的后上方，腺垂體的前、后方薄，兩側(cè)方大致呈三棱錐體形，尖端向前。各組間垂體肉眼觀無明顯差異。

2.2.2 垂體HE染色 光鏡檢查結(jié)果大鼠腦垂體可區(qū)分嗜酸性細胞、嗜堿性細胞及嫌色細胞，分界清楚，各組間各類細胞比例正常，但模型組腦垂體細胞分布密度稍稀，部分細胞核固縮，細胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化。其余3組垂體各類細胞無變性、壞死，未出現(xiàn)去勢細胞。見圖3。

圖3 光鏡下觀察大鼠垂體細胞形態(tài)(HE×200)Figure 3 Morphology of the pituitary cells in different groups of rats observed under the light microscope(HE×200)

2.2.3 透射電鏡觀察垂體形態(tài) 空白組垂體細胞核形態(tài)正常，細胞質(zhì)內(nèi)含有明顯的核旁高爾基復合體，有豐富的線粒體及分泌顆粒;模型組中細胞核明顯皺縮變形，核染色質(zhì)凝聚，細胞器排列紊亂，線粒體內(nèi)腔腫脹，擴張形成空泡狀。中藥低、高劑量組均表現(xiàn)為細胞核形態(tài)規(guī)則，核旁高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，無明顯腫脹，可見部分分泌顆粒。見圖4。

2.3 卵巢的形態(tài)學改變

2.3.1 卵巢結(jié)構(gòu)肉眼觀 中藥低、高劑量組卵巢較空白組和模型組明顯增大，質(zhì)地疏松，解剖顯微鏡下可見明顯增多的黃體;而模型組卵巢體積稍小，質(zhì)地較韌。

2.3.2 HE染色光鏡檢查結(jié)果 顯微鏡下計數(shù)生長卵泡、黃體和閉鎖卵泡數(shù)。4組間比較空白組生長卵泡數(shù)量較多，黃體細胞發(fā)育好，體積大，顆粒細胞層較厚(多為5～6層);模型組卵巢內(nèi)閉鎖卵泡數(shù)量較多，顆粒細胞較少，顆粒細胞層次減少(多為2～3層)，排列松散，卵母細胞放射冠消失;中藥低劑量組卵巢內(nèi)黃體數(shù)量較模型組增多，發(fā)育好，體積大，卵巢閉鎖卵泡數(shù)量減少;中藥高劑量組卵巢內(nèi)生長卵泡數(shù)量多，卵泡顆粒細胞層較厚(多為6～7層)，顆粒細胞豐富，黃體數(shù)量多，發(fā)育好。見圖5。

圖4 透射電鏡觀察大鼠垂體形態(tài)(×1500)Figure 4 Morphology of the pituitary cells in different groups of rats observed under the transmission electron microscope(×1500)

圖5 光鏡下觀察大鼠卵巢細胞形態(tài)(HE×200)Figure 5 Morphology of the ovarian cells in different groups of rats observed under the light microscope(HE×200)

2.3.3 各組卵巢卵泡及黃體個數(shù)的比較 模型組各級卵泡數(shù)及黃體數(shù)目明顯減少，中藥低、高劑量組均能增加卵泡數(shù)及黃體數(shù)，見表1。

2.4 子宮的形態(tài)學改變 子宮由內(nèi)膜、肌層及外膜組成，外觀各組未見明顯差異。HE染色光鏡檢查見空白組子宮固有層組織疏松，間質(zhì)細胞肥大，可見多量子宮腺體，間質(zhì)血管豐富;模型組子宮內(nèi)膜層較空白組變薄，管壁子宮腺體數(shù)量減少，腺腔較空白組小，間質(zhì)膠原纖維增多;中藥低劑量組子宮內(nèi)膜厚度和模型組接近，管壁子宮腺體數(shù)量較模型組略多，腺腔增大;中藥高劑量組內(nèi)膜厚度較低劑量組厚，管壁子宮腺體數(shù)量較模型組增多，腺腔增大，肌層間血管數(shù)量多、擴張充血，漿膜層無異常。見圖6。

表1 各組大鼠卵泡數(shù)目及黃體數(shù)目的比較(±s)Table 1 Numbers of follicles and corpora lutea in different groups of rats(±s)

表1 各組大鼠卵泡數(shù)目及黃體數(shù)目的比較(±s)Table 1 Numbers of follicles and corpora lutea in different groups of rats(±s)

與模型組比較，*P ＜0.05

組別 n 各級卵泡數(shù)(個) 黃體數(shù)(個)空白組 10 32.30 ±2.63* 25.30 ±2.67*模型組 10 23.70 ±2.31 16.40 ±2.20中藥低劑量組 9 25.33 ±2.35 23.07 ±2.50*中藥高劑量組 8 31.87 ±2.23* 22.37 ±1.93*

圖6 光鏡下觀察大鼠子宮形態(tài)(HE×200)Figure 6 Uterine morphology in different groups of rats under the light microscope(HE×200)

3 討 論

LPD系指排卵后黃體發(fā)育不良、黃體過早退化、孕激素分泌不足和子宮內(nèi)膜分泌反應性降低;臨床上以分泌期子宮內(nèi)膜發(fā)育延遲，內(nèi)膜發(fā)育與孕卵發(fā)育不同步為主要特征，其臨床特點為不孕和反復的早期流產(chǎn)［5］。該病在育齡女性中的自然患病率為5%左右，在不孕女性中占10%，在習慣性流產(chǎn)女性中最高可達60%左右，對女性的身心健康造成嚴重的威脅［6］。國外研究也證實:在自然月經(jīng)周期，育齡期女性LPD發(fā)病率為3% ～10%;在超促排卵周期，LPD的發(fā)生率幾乎100%［7］。黃體是排卵后卵泡形成的富有血管的暫時性內(nèi)分泌腺，是甾體激素的主要來源［8］，黃體實質(zhì)內(nèi)的黃體細胞主要合成孕激素［9］。引起 LPD 的原因涉及下丘腦-垂體-卵巢-子宮軸的各個環(huán)節(jié)，該軸功能的紊亂引起子宮內(nèi)膜組織時相和性激素分泌時相失去同步化［10］。前期研究已證實補腎助孕方對于改善卵巢的內(nèi)分泌功能具有良好的功效，且能改善黃體的功能，提高子宮內(nèi)膜的容受性［11-12］。米非司酮是19一去甲類固醇炔諾酮的衍生物，它能與孕激素受體和糖皮質(zhì)激素受體相結(jié)合而發(fā)揮藥理作用，具有抗孕激素及抗糖皮質(zhì)激素和微量的抗雄激素作用，可以直接或間接作用于下丘腦-垂體-卵巢軸，延遲、抑制卵泡發(fā)育和排卵［13-14］。國外研究表明，米非司酮對子宮內(nèi)膜的影響要大于下丘腦和垂體［15］，而國內(nèi)有研究者報道:給大鼠使用小劑量米非司酮后，垂體促性腺細胞與對照組相比，體積減小，細胞質(zhì)變少且形狀欠規(guī)則，細胞質(zhì)內(nèi)液泡減少或消失，可見細胞質(zhì)突起似樹突狀細胞［16］。米非司酮引起的內(nèi)分泌失衡狀態(tài)是否系性腺軸各環(huán)節(jié)的超微結(jié)構(gòu)改變影響到細胞合成、分泌蛋白質(zhì)的功能所致?本研究用米非司酮構(gòu)建LPD大鼠模型，從形態(tài)學角度觀察下丘腦-垂體-卵巢-子宮軸各部位的形態(tài)學變化，且進一步觀察補腎助孕方對性腺軸的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變是否具有改善作用。

研究結(jié)果提示米非司酮對LPD模型大鼠的下丘腦-垂體-卵巢-子宮各個環(huán)節(jié)均產(chǎn)生了不良影響，光鏡下下丘腦和垂體各組間差異不明顯，但電鏡下下丘腦及垂體的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了改變，各組間細胞器的結(jié)構(gòu)、外形均有明顯差異，經(jīng)中藥干預后，上述情況有所改善，據(jù)此可以推測:短期使用米非司酮不僅會影響性腺軸的內(nèi)分泌功能，同時還能對下丘腦及垂體的超微結(jié)構(gòu)造成影響，但此種影響是可逆的，可通過藥物干預得以糾正;米非司酮對卵巢及子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響較為明顯，抑制卵泡的生長，使卵泡數(shù)量減少，同時由于米非司酮的溶黃體作用，可觀察到模型組大鼠卵巢中黃體數(shù)量減少，中藥組黃體數(shù)量明顯增多;模型組子宮腺體數(shù)量減少，腺腔變小，間質(zhì)膠原纖維增多，中藥高劑量組子宮內(nèi)膜厚度增加，腺體數(shù)量增多，腺腔增大，肌層間血管數(shù)量多，這與課題組的前期研究結(jié)果是一致的［17-18］。由此可以推測:補腎助孕方除能改善性腺軸的內(nèi)分泌功能外，尚能對LPD大鼠的下丘腦-垂體-卵巢軸各部位形態(tài)結(jié)構(gòu)起到改善的作用。

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