王曉礽，劉秀華，王 松，欒 康

肌纖生成調(diào)節(jié)因子-1促肌節(jié)F-actin組裝引起新生乳大鼠心肌細(xì)胞肥大

王曉礽，劉秀華，王 松，欒 康

目的 探索肌纖生成調(diào)節(jié)因子-1(myofibrillogenesis regulator-1，MR-1)通過(guò)調(diào)節(jié)肌原纖維生成引起心肌肥大的機(jī)制。方法 干預(yù)MR-1在體外培養(yǎng)的新生乳大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)，檢測(cè)心肌細(xì)胞表面積、心房利鈉因子和腦鈉肽水平及蛋白合成速率3種心肌肥大指標(biāo)的變化，以鬼筆環(huán)肽-異硫氰酸熒光素標(biāo)志并觀察肌節(jié)F-actin組裝，以半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、免疫印跡和細(xì)胞免疫熒光術(shù)檢測(cè)重要肌節(jié)分子myomesin-1、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈-2(myosin light chain-2，MLC-2)含量及亞細(xì)胞定位。結(jié)果 MR-1過(guò)表達(dá)引起心肌細(xì)胞肥大、肌節(jié)F-actin組裝明顯促進(jìn)、MLC-2與myomesin-1表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)以及myomesin-1的細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位；MR-1沉默后小泛素樣調(diào)節(jié)因子-1過(guò)表達(dá)引起的轉(zhuǎn)位和肌節(jié)F-actin組裝明顯抑制。結(jié)論 MR-1通過(guò)促進(jìn)myomesin-1和MLC-2調(diào)節(jié)肌原纖維生成引起心肌細(xì)胞肥大。

肌纖生成調(diào)節(jié)因子-1；心肌細(xì)胞肥大；F-actin；Myomesin-1；肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈-2

心肌肥大是缺血、機(jī)械牽張、激素和細(xì)胞因子等因素引起的心肌適應(yīng)性反應(yīng)，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、質(zhì)量增加和間質(zhì)細(xì)胞增生，涉及一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[1]。其中占心肌組織90%以上的心肌細(xì)胞肥大是心肌肥大的關(guān)鍵因素。作為興奮收縮偶聯(lián)的重要環(huán)節(jié)，心肌肌原纖維直接決定著心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中的結(jié)構(gòu)和功能重塑，在調(diào)節(jié)肥大過(guò)程中代償性心肌收縮功能發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肌節(jié)蛋白高度有序和準(zhǔn)確的組裝是肌肉細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能維持的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-3]，肌節(jié)組裝過(guò)程的準(zhǔn)確性對(duì)心肌細(xì)胞功能有重要的影響[4]，因而了解心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中的肌節(jié)組裝，特別是明確重要肌節(jié)分子的調(diào)節(jié)，對(duì)于闡明心肌肥大的機(jī)制有重要的理論推動(dòng)意義。

人肌纖生成調(diào)節(jié)因子-1(myofibrillogenesis regulator-1，MR-1，收錄號(hào) AF417001)[5]定位于染色體2q35[6-7]，mRNA全長(zhǎng)755 bp，編碼一段142個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在橫紋肌組織、肝臟和腎臟組織等高表達(dá)[2]。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)MR-1在腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)高血壓致心肌肥大大鼠的心臟組織和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型中表達(dá)顯著升高，而RNA干擾(RNA interference，RNAi)致MR-1表達(dá)抑制可消除AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，提示MR-1與心肌肥大關(guān)系密切；Li等[5]通過(guò)酵母雙雜交和GST-pull down實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)定位于肌原纖維的MR-1與重要的肌節(jié)結(jié)構(gòu)即肌節(jié)分子 myomesin-1、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈-2(myosin light chain-2，MLC-2)與MR-1分子均有直接的相互作用。Myomesin-1是重要的肌節(jié)M線調(diào)控分子，對(duì)于肌原纖維的形態(tài)和功能維持都具有關(guān)鍵的作用。MLC-2作為肌肉收縮裝置的調(diào)節(jié)蛋白，參與了正常生理狀態(tài)下肌節(jié)結(jié)構(gòu)的維持以及特定信號(hào)如心肌肥大信號(hào)刺激下的心肌重塑。因此，MR-1可能通過(guò)影響myomesin-1、MLC-2調(diào)節(jié)的肌原纖維生成過(guò)程，促進(jìn)心肌肌原纖維生成而引起心肌肥大。為此本研究在體外培養(yǎng)的Sprauge-Dawly新生乳大鼠心肌細(xì)胞模型中通過(guò)外源性過(guò)表達(dá)和內(nèi)源性抑制MR-1水平，研究MR-1干預(yù)對(duì)心肌細(xì)胞肥大指標(biāo)、肌原纖維生成以及重要肌節(jié)分子myomesin-1、MLC-2變化的影響。

1 材料與方法

1.1 新生乳大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 用于實(shí)驗(yàn)的新生乳大鼠心肌細(xì)胞從24 h內(nèi)新生的清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠[由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK-2011-0039)提供]心室肌組織分離得到，培養(yǎng)方法參照Simpson和Savion[8]的步驟加以改進(jìn)[9]:新生乳大鼠消毒后無(wú)菌操作取心尖部組織，剪碎成1 mm× 1 mm×1 mm大小，加入適量0.08%胰蛋白酶于37℃水浴下機(jī)械振蕩、反復(fù)消化，制備心肌細(xì)胞懸液，差速貼壁法去除非心肌細(xì)胞，用含10%胎牛血清(奧地利，PAA)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)調(diào)整細(xì)胞為3×106/mL后，每瓶7.5 mL懸液接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，于5%CO2、37℃的孵箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)；之后每日全量更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)3 d后可進(jìn)行繼代培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞以不同的處理方法分為5組。①正常對(duì)照組，心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。②MR-1過(guò)表達(dá)組，Lipofectamin 2000(美國(guó)，Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染構(gòu)建的MR-1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDB-MR-1[10]，轉(zhuǎn)染方法參照Invitrogen公司的操作手冊(cè)。③MR-1抑制組，RNAi技術(shù)沉默內(nèi)源性MR-1。在以Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染穩(wěn)定型小時(shí)序 RNA(small temporal RNA，stRNA)[11]之前，先進(jìn)行沉默效率檢測(cè)從而選擇優(yōu)勢(shì)stRNA序列。以BLOCK-iTTMRNAi Designer軟件針對(duì)MR-1基因(NM_001134753.1)設(shè)計(jì)3個(gè)雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)靶點(diǎn)，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選一個(gè)優(yōu)勢(shì)序列為5′-CGACAGCU AACAAGGCUUCCCAGAA-3′。④空載對(duì)照組，pcDB空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。⑤隨機(jī)RNA對(duì)照組，25 bp的隨機(jī)dsRNA轉(zhuǎn)染。

1.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 原代培養(yǎng)的新生乳大鼠心肌細(xì)胞消化后以1.5×104/cm2接種60 mm規(guī)格的培養(yǎng)皿，次日進(jìn)行處理，48 h后收獲細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)步驟參照Easy-Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)操作手冊(cè)。根據(jù)目的基因互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)設(shè)計(jì)新生乳大鼠源性磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)、MR-1、心房利鈉因子(atrial natriuretic facto，ANF)、腦鈉肽(brain natriuretie peptide，BNF)、myomesin-1、MLC-2和MR-1引物，序列如表1所示。PCR擴(kuò)增條件為50℃保溫30 min、94℃變性2 min、94℃變性15 s、退火30 s (退火溫度根據(jù)不同引物設(shè)為不同的Tm-5℃)、72℃1 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)觀察并采集圖像。

1.3 免疫印跡檢測(cè) 以1.5×104/cm2將細(xì)胞接種至100 mm培養(yǎng)皿，次日貼壁后進(jìn)行各種處理，培養(yǎng)48 h后以放射免疫沉淀試驗(yàn)全細(xì)胞裂解液(500 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、150 mmol/L NaCl、0.1%十二烷基磺酸鈉、1%乙基苯基聚乙二醇、0.5%脫氧膽酸鈉、0.5 mmol/L二硫蘇糖醇、100 μmol/L苯甲基磺酰氟，pH 8.0)裂解細(xì)胞并提取蛋白，以Bradford法[12]蛋白定量后取含有50～100 μg蛋白的上清液與5×上樣緩沖液(250 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、20%十二烷基磺酸鈉、0.5%溴酚藍(lán)、50%甘油、5%β-巰基乙醇，pH 6.8)混合煮沸10 min，離心取上清進(jìn)行聚丙酰胺凝膠電泳。根據(jù)目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別選擇分離膠濃度: MR-1、MLC-2小相對(duì)分子質(zhì)量蛋白分離用12%的凝膠，myomesin-1則用8%的凝膠。電泳后以半干式法電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，0.01 mol/L TBST(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、150 mmol/L NaCl、8 mmol/L疊氮鈉、0.01%吐溫-20，pH 7.5)配制的50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗于4℃過(guò)夜雜交。不同抗體分別為MR-1(自制多抗，1∶200)[13]、MLC-2(美國(guó)，Santa Cruz公司，1∶200)、myomesin-1(美國(guó)，Santa Cruz公司，1∶100)、GAPDH (美國(guó)，Santa Cruz公司，1∶500)；TBST洗滌3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志的二抗(TBST配制，1∶1 000)，室溫作用1 h；充分洗滌后進(jìn)行發(fā)光顯影。

1.4 [3H]-亮氨酸摻入法 原代培養(yǎng)的新生乳大鼠心肌細(xì)胞按1×104/cm2接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)后換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為5組(每組平行孔n＝3)，于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)加入[3H]-亮氨酸(10 μCi/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)以4℃預(yù)冷的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS，154 mmol/L NaCl、1.9 mmol/L NaH2PO4、8.1 mmol/L Na2HPO4)沖洗2次，吸干廢液，加入2 mL閃爍液，反應(yīng)15 min后在液閃儀(美國(guó)，PerkinElmerTMWallac 1450)上測(cè)定[3H]-亮氨酸放射性強(qiáng)度，單位為校正的每分鐘細(xì)胞計(jì)數(shù)(calibrated counts·min-1，ccpm)，反映心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率。

1.5 細(xì)胞表面積測(cè)量實(shí)驗(yàn) 原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞按1×104/cm2接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)后換無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h和48 h后各隨機(jī)分為正常對(duì)照組、MR-1過(guò)表達(dá)組和空載對(duì)照組3組，每組3個(gè)平行孔在倒置顯微鏡(日本，Olympus公司，BH-2)視野下(×200)觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行錄像，每孔隨機(jī)采5個(gè)視野，每視野測(cè)定10～15個(gè)細(xì)胞表面積，取平均值。

1.6 細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞處理48 h后以PBS洗滌3次，－20℃預(yù)冷的冰甲醇預(yù)固定5 min，2.5%戊二醛固定30 min。以含有0.2%聚乙二醇辛基苯基醚的10%正常驢血清(美國(guó)，Santa Cruz公司)封閉30 min后，以1%牛血清白蛋白稀釋的一抗MR-1(自制，1∶100)[13]、MLC-2(1∶100，美國(guó)，Santa Cruz公司)、myomesin-1(1∶100，美國(guó)，Santa Cruz公司)孵育2 h或鬼筆環(huán)肽-異硫氰酸熒光素(美國(guó)，Sigma公司，1∶100)染料工作液避光孵育1 h；一抗孵育后以PBS充分洗滌，與相應(yīng)的熒光二抗工作液雜交反應(yīng)。熒光二抗以PBS配制，稀釋度分別為羅丹明標(biāo)志的驢抗兔熒光二抗(1∶400)、異硫氰酸熒光素標(biāo)志的驢抗山羊熒光二抗(1∶200)免疫印跡。二抗在室溫下避光孵育 2 h，雜交結(jié)束前 10 min以 Hoechst 33258(美國(guó)，Merck-Calbiochem公司)襯染細(xì)胞核，反應(yīng)充分洗滌后用50%的甘油-PBS封片，激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)，Zeiss公司，LSM-510 Meta)觀察并采集圖像。

1.7 半定量分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Image-Pro Plus (IPP)專業(yè)圖像分析軟件[14](4.1版，美國(guó)，Media Cybernetics公司)分析RT-PCR、免疫印跡條帶的積分光密度(integral optical density，IOD)，并與內(nèi)參照GAPDH的IOD進(jìn)行比率計(jì)算，不同引物或抗體反應(yīng)后若在同一表中顯示(表1)其IOD，則以它們的正常對(duì)照組為原點(diǎn)，將其IOD校正為1.000，得到的各組相對(duì)值作柱狀圖；新生乳大鼠心肌細(xì)胞表面積測(cè)量及分析同樣用IPP圖像分析軟進(jìn)行，單位為平方微米(μm2)。應(yīng)用SPSS 11.0分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，多組間兩兩比較用Bonferroni′s test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RT-PCR引物

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-MR-1及細(xì)胞表面積 檢測(cè)MR-1過(guò)表達(dá)的心肌細(xì)胞模型，在pcDNA3.1-MR-1轉(zhuǎn)染8、16、24、48 h時(shí)MR-1的水平比空載對(duì)照組分別高1.6、2.8、3.4、3.4倍(P＜0.05，圖1A)。通過(guò)[3H]-亮氨酸摻入法、細(xì)胞表面積測(cè)定以及ANF和BNP轉(zhuǎn)錄水平評(píng)估心肌細(xì)胞肥大，與空載對(duì)照組比較，pcDNA3.1-MR-1轉(zhuǎn)染24 h后，ANF和BNP mRNA水平分別高1.1、0.9倍(P＜0.05，圖1B)；轉(zhuǎn)染48 h后，[3H]-亮氨酸摻入法代表的蛋白合成速率比空載對(duì)照組高0.9倍[(3 333.5±106.1)ccpm與(1 789.3± 83.0)ccpm，P＜0.05，圖1C]，而細(xì)胞平均表面積則高1.0倍[(18 487.9±3 804.9)μm2與(8 998.2± 1 427.7)μm2，P＜0.05，圖1D]。

圖1 MR-1的相對(duì)表達(dá)水平及MR-1轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞肥大指標(biāo)測(cè)量(?P＜0.05)

2.2 MR-1的定位與排布 在正常培養(yǎng)48 h后心肌細(xì)胞以細(xì)胞免疫熒光術(shù)對(duì)MR-1分別與肌節(jié)Z帶的標(biāo)志分子α-actinin和A帶標(biāo)志分子MLC-2進(jìn)行雙標(biāo)染色，MR-1主要定位于α-actinin染色陰性(圖2A)、MLC-2陽(yáng)性(圖2B)的橫紋肌樣區(qū)域，MR-1與MLC-2共定位明顯。在MR-1條帶正中有明顯的暗帶(圖2B)，清晰地顯示了肌節(jié)中的H帶。

在正常培養(yǎng)1～3 d的心肌細(xì)胞中，大多數(shù)細(xì)胞中的MR-1保持了點(diǎn)狀、纖細(xì)、整齊且完整的肌原纖維結(jié)構(gòu)(圖2C，正常對(duì)照組)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MR-1的細(xì)胞排布發(fā)生了規(guī)律的變化，多數(shù)心肌細(xì)胞中的MR-1從前期的未成熟型變?yōu)槌墒鵂畹摹⒚靼迪嚅g呈典型橫紋肌樣(striated like)的成熟型排布方式。這種變化很快即可在pcDNA3.1-MR-1轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞中觀察到。正常培養(yǎng)1 d后轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MR-1 16 h后，在大多數(shù)心肌細(xì)胞中即可觀察到高度有序的、組織良好的橫紋肌樣MR-1排布(圖2C，MR-1過(guò)表達(dá)組)。2種MR-1的排布模式(未成熟的纖維絲樣和成熟的橫紋肌樣)可在同一個(gè)心肌細(xì)胞中被觀察到，如pcDNA3.1-MR-1轉(zhuǎn)染16 h的心肌細(xì)胞中顯示2種MR-1排布結(jié)構(gòu)(圖2C，空載對(duì)照組)。

圖2 MR-1亞細(xì)胞定位及其在心肌肌原纖維的排布

2.3 肌節(jié)組裝

2.3.1 肌節(jié)F-actin聚合和組裝 以鬼筆環(huán)肽-異硫氰酸熒光素染料對(duì)培養(yǎng)1 d而后轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MR-1 8～24 h的心肌細(xì)胞進(jìn)行F-actin細(xì)胞骨架的標(biāo)志，通過(guò)計(jì)數(shù)表現(xiàn)為肌節(jié)F-actin(橫紋肌樣結(jié)構(gòu))的心肌細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比率對(duì)心肌細(xì)胞的肌節(jié)組裝程度進(jìn)行評(píng)估，正常對(duì)照組的心肌細(xì)胞多呈應(yīng)力纖維樣(stress fiber-like)結(jié)構(gòu)，空載對(duì)照組與之類似(圖3A)。MR-1轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染8 h后即顯示快速的肌節(jié)組裝。超過(guò)2/3的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)肌節(jié)組裝良好的模式。與轉(zhuǎn)染空載對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-MR-1 8 h后肌節(jié)組裝良好的心肌細(xì)胞比率高0.6倍[(34.5±5.5)%與(21.6±7.6)%，P＞0.05]，轉(zhuǎn)染16 h后高1.0倍[(58.1±4.3)%與(29.1±5.3)%，P＜0.01]，轉(zhuǎn)染24 h后則高1.3倍[(62.1±5.4)%與(26.4±4.8)%，P＜0.01]。進(jìn)一步以F-/G-actin組分分離結(jié)合免疫印跡檢測(cè)方法半定量分析纖維樣型的肌動(dòng)蛋白 F-actin與單體型的 G-actin的比值，pcDNA3.1-MR-1轉(zhuǎn)染16 h后心肌細(xì)胞中F-/G-actin比率比空載對(duì)照組高3.3倍(P＜0.05，圖3B，n＝3)。

2.3.2 心肌細(xì)胞肌節(jié)分子myomesin-1和MLC-2的表達(dá) MR-1轉(zhuǎn)染24 h后，與空載對(duì)照組比較，myomesin-1和MLC-2的mRNA水平分別高6.7倍和3.2倍(P＜0.01，圖3C-a，)。與之類似，MR-1轉(zhuǎn)染24 h后myomesin-1和MLC-2的蛋白水平比空載對(duì)照組明顯高24.4倍和3.0倍(P＜0.01，圖3C-b、c)。

圖3 MR-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染新生大鼠心肌細(xì)胞引起快速的肌節(jié)組裝(?P＜0.05)

2.3.3 心肌細(xì)胞肌節(jié)Z線的發(fā)育 測(cè)量2條相鄰Z線間的距離作為評(píng)估肌節(jié)組裝成熟度的指標(biāo)之一，MR-1轉(zhuǎn)染明顯促進(jìn)了Z線距離的增加，在MR-1轉(zhuǎn)染不同的時(shí)間段分別與空載對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染8 h后2條Z線間距分別為(1.62±0.06)μm、(1.47± 0.04)μm，轉(zhuǎn)染16 h后為(1.79±0.07)μm、(1.53± 0.06)μm，轉(zhuǎn)染24 h則為(1.93±0.08)μm、(1.72± 0.04)μm(P＜0.05)。

2.4 肌節(jié)組裝的分子結(jié)構(gòu)

2.4.1 Myomesin-1的細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位 在新生乳大鼠心肌細(xì)胞模型中以細(xì)胞免疫熒光研究發(fā)現(xiàn)，myomesin-1主要定位于正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞核中(圖4A，正常對(duì)照組)，轉(zhuǎn)染空載對(duì)照組不影響其定位分布(圖4A，空載對(duì)照組)，但MR-1轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞核定位的myomesin-1轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)(圖4A，MR-1過(guò)表達(dá)組)。

2.4.2 MR-1對(duì)myomesin-1小泛素樣調(diào)節(jié)因子化修飾 將構(gòu)建的pcDNA3.1-小泛素樣調(diào)節(jié)因子-1 (small ubiquitin-like modifier-1，SUMO-1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞24 h，myomesin-1細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位效果與MR-1轉(zhuǎn)染效果一致(圖4A，SUMO-1)。以MR-1-siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞抑制內(nèi)源性MR-1的表達(dá)后，多數(shù)myomesin-1仍定位在細(xì)胞核中(圖4A，MR-1抑制組)。在心肌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染MR-1-siRNA和SUMO-1質(zhì)粒，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染SUMO-1質(zhì)粒不同的是myomesin-1仍然定位于細(xì)胞核中，少數(shù)則在細(xì)胞核周區(qū)域(圖4A，SUMO-1＋MR-1抑制組)。檢測(cè)心肌細(xì)胞肌節(jié)F-actin組裝程度，單純轉(zhuǎn)染SUMO-1后肌節(jié)組裝良好的心肌細(xì)胞由(59.8±6.9)%降低為共轉(zhuǎn)染MR-1-siRNA和 SUMO-1質(zhì)粒后的(22.1±6.4)%(P＜0.05，圖4B)。

檢測(cè)pcDNA3.1-MR-1轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞中的SUMO-1水平與空載對(duì)照組比較，MR-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中SUMO-1的mRNA和蛋白水平均無(wú)明顯升高(P＞0.05)。

圖4 Myomesin-1轉(zhuǎn)位及SUMO-1誘導(dǎo)肌節(jié)組裝

3 討論

本研究基于心肌肥大相關(guān)的新基因MR-1，證實(shí)了MR-1過(guò)表達(dá)直接誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的新生乳大鼠心肌細(xì)胞肥大，表現(xiàn)為ANF和BNP水平明顯上調(diào)、蛋白合成速率明顯促進(jìn)以及細(xì)胞平均表面積明顯增大，提示MR-1是引起心肌細(xì)胞肥大的充分條件。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中以特異性結(jié)合于早期凋亡細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸的annexinⅤ-異硫氰酸熒光素結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞凋亡情況，與正常對(duì)照組和空載對(duì)照組比較，并未發(fā)現(xiàn)MR-1轉(zhuǎn)染48 h以內(nèi)的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出明顯增加的凋亡率；在轉(zhuǎn)染的48 h時(shí)段中，心肌細(xì)胞盡管肌原纖維生成增加，但未表現(xiàn)出肌原纖維排布紊亂等病理性肥大的現(xiàn)象，提示MR-1過(guò)表達(dá)48 h誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大為代償性的生理性肥大。MR-1在AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中明顯上調(diào)[6]，但其他肥大刺激因子是否也有同樣誘導(dǎo)MR-1上調(diào)的效果目前尚未闡明。

前期的免疫組化結(jié)果證實(shí)，MR-1定位于心肌肌原纖維，與幾種關(guān)鍵的肌肉收縮蛋白有相互作用[5]，提示MR-1可能與調(diào)節(jié)肌原纖維生成有關(guān)。本研究首次檢測(cè)到MR-1定位于肌節(jié)的A帶，與MLC-2分子有明顯的共定位，提示MR-1可能本身即作為心肌細(xì)胞肌節(jié)的結(jié)構(gòu)分子發(fā)揮作用。為進(jìn)一步明確其功能，檢測(cè)了肌原纖維的組成分子F-actin，特別關(guān)注了F-/G-actin比率及含有組裝良好的肌節(jié)F-actin的心肌細(xì)胞比率。此外，還觀察了另外2種重要肌節(jié)分子myomesin-1和MLC-2的表達(dá)與轉(zhuǎn)位。在肌節(jié)組裝中，相鄰M線的距離始終保持在2.0 μm左右，但相鄰2條Z線的距離從肌節(jié)組裝早期的1.1 μm增加到成熟階段的2.0 μm[15]。以細(xì)胞免疫熒光術(shù)標(biāo)志了Z線標(biāo)志物α-actinin并以激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM-510 Meta)自帶圖像分析軟件測(cè)量了Z線間平均距離，與空載對(duì)照組比較，pcDNA3.1-MR-1轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)快速的F-actin聚合、肌節(jié)F-actin的快速組裝/相鄰Z線間距的明顯增加，以及肌節(jié)蛋白MLC-2和myomesin-1的表達(dá)水平明顯上調(diào)。有趣的是，這些變化都出現(xiàn)在pcDNA3.1-MR-1轉(zhuǎn)染24 h后，發(fā)生在心肌細(xì)胞表面積和蛋白合成速率增加肥大表型出現(xiàn)之前(pcDNA3.1-MR-1轉(zhuǎn)染48 h后)，提示MR-1調(diào)節(jié)的肌節(jié)組裝的促進(jìn)可能是引起心肌細(xì)胞肥大的重要原因。

本研究探究了MR-1調(diào)節(jié)肌節(jié)組裝的分子機(jī)制，185×104相對(duì)分子質(zhì)量的M線標(biāo)志蛋白myomesin-1與肌聯(lián)蛋白和肌球蛋白有相互作用[16-19]，在調(diào)節(jié)肌節(jié)組裝、維持肌節(jié)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)肌肉分化方面具有關(guān)鍵的意義[20-22]，因而被認(rèn)為是最重要的肌節(jié)M線蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的MR-1明顯促進(jìn)myomesin-1的轉(zhuǎn)位及上調(diào)，提示MR-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)myomesin-1這一關(guān)鍵靶點(diǎn)促進(jìn)肌節(jié)組裝。

SUMO是一種轉(zhuǎn)錄后修飾蛋白，含有101個(gè)氨基酸殘基，具有通過(guò)SUMO化信號(hào)途徑調(diào)節(jié)其他蛋白的亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄活性功能。在這一過(guò)程中，SUMO小肽必須通過(guò)目標(biāo)蛋白上的WKXE序列對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，而后與該蛋白上的賴氨酸殘基發(fā)生共價(jià)結(jié)合[23-24]。Reddy等[20]提出了myomesin-1是肌肉分化中某種未知蛋白表達(dá)所必須的假說(shuō)。這種未知蛋白一旦表達(dá)后，SUMO化的myomesin-1將從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)出，開(kāi)始有序地整合進(jìn)入位于細(xì)胞質(zhì)的肌節(jié)中。然而，在新生動(dòng)物心肌細(xì)胞核中SUMO-1和(或)SUMO共價(jià)機(jī)制并未發(fā)育完全，因而大部分myomesin-1仍舊滯留于細(xì)胞核中[15]。作者發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SUMO-1促進(jìn)了myomesin-1的轉(zhuǎn)位和心肌細(xì)胞的肌節(jié)組裝，這一現(xiàn)象與過(guò)表達(dá)MR-1的結(jié)果十分類似。然而，SUMO-1誘導(dǎo)的myomesin-1轉(zhuǎn)位和上調(diào)在SUMO-1與MR-1 siRNA共轉(zhuǎn)染時(shí)被明顯抑制，提示MR-1在SUMO介導(dǎo)的myomesin-1轉(zhuǎn)位中是必要條件，myomesin-1可能受到MR-1相關(guān)的SUMO化機(jī)制調(diào)節(jié)。進(jìn)一步檢測(cè)MR-1轉(zhuǎn)染后SUMO-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá) MR-1并未上調(diào)SUMO-1的表達(dá)水平，因而提示MR-1可能通過(guò)加強(qiáng)myomesin-1與SUMO分子的結(jié)合而非促進(jìn)其合成的方式調(diào)節(jié)myomesin-1的功能，證實(shí)myomesin-1的SUMO化對(duì)其功能的發(fā)揮十分重要[17]。綜上表明，過(guò)表達(dá)MR-1通過(guò)促進(jìn)SUMO化myomesin-1介導(dǎo)的肌節(jié)組裝誘導(dǎo)新生乳大鼠心肌細(xì)胞肥大。

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Myofibrillogenesis regulator-1 induces hypertrophy by promoting sarcomere organization in neonatal rat cardiomyocytes

WANG Xiaoreng，LIU Xiuhua，WANG Song，LUAN Kang
(Department of Pathophysiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China)

Objective Exploration of myofibrillogenesis reguiator-1(MR-1)by regulating the generation mechanism of causing myofibrillar hyperlrophy of the cardigmyocytes.Methods After intervention of MR-1 expressions in neonatal rat cardiomyocytes，we measured several hypertrophic index e.g.the mRNA levels of the atrial natriuretic factor(ANF)and brain natriuretic peptide(BNP)，the cell size，and the velocity of protein synthesis.The sarcomeric F-actin organization were detacted by staining with phalloidin-fluorescein isothiocyanate(FITC)；sublocation of myomesin-1 and myosin regulatory light chain(MLC-2)were assessed by semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)，western blot，and immunocytofluorescent assays. Results MR-1 overexpression induced cardiomyocyte hypertrophy，promoted the sarcomeric F-actin organization，increased the expression of MLC-2 and myomesin-1(P＜0.05)，as well as the myomesin-1 translocation from nucleus to cytoplasm.Those results of myomesin-1 translocation and F-actin organization were similar to the small ubiquitin modifier-1(SUMO-1)overexpression，MR-1 inhibition by RNA interference did not induce the translocation of myomesin-1，even decrease the SUMO-1 overexpression induced myomesin-1 translocation，as well as the promoted F-actin organization. Conclusion MR-1 induces cardiomyocytes hypertrophy by promoting the MLC-2 and myomesin-1 induced myofibrillogenesis.

Myofibrillogenesis regulator-1(MR-1)；Cardiomyocyte hypertrophy；F-actin；Myomesin-1；Myosin light chain-2(MLC-2)

R542.2－332

A

2095-3097(2015)01-0037-08

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.01.011

2014-12-20 本文編輯:徐海琴)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30770902)；國(guó)家自然科學(xué)基金重大國(guó)際合作資助項(xiàng)目(30620130111)

100853北京，解放軍總醫(yī)院病理生理研究室(王曉礽，劉秀華，王 松，欒 康)

劉秀華，E-mail:xiuhualiu98＠163.com.cn