劉璇 ,楊益,李瑾慧,孫走南,唐玥,蘇文莉,劉京梅,于雅琴,常國輝
1.吉林大學 公共衛(wèi)生學院,吉林 長春 130021;2.軍事醫(yī)學科學院 疾病預防控制所,北京 100071
植物多酚是一類種類繁多的高分子多元酚化合物,為植物的次級代謝產(chǎn)物,廣泛存在于植物體的葉、果肉及樹皮中,包括藥材、糧食、水果和蔬菜等,并且有很強的生物學活性,能與蛋白質(zhì)、核酸和金屬離子等相互作用[1-3]。單寧酸(tannic acid)是簡單的水解類植物多酚,其抗腫瘤、抗氧化及抗感染等特性已多有報道[4]。近年來,單寧酸作為廣譜低毒的病毒抑制劑而備受研究者關(guān)注[5]。單寧酸的生物學效應可能與其和細胞膜相互作用的能力密切相關(guān)[6]。膜熒光各向異性和跨膜電位是細胞膜的重要生物物理學特性,有研究表明,病毒侵入可改變宿主細胞膜的流動性和膜電位[7-8]。因此,我們以痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)WR(Western Reserve)株為研究對象,測定病毒感染對細胞膜流動性和膜電位的影響及單寧酸的干預作用,為揭示單寧酸抑制病毒感染的作用機制提供實驗依據(jù)。
Vero E6 細胞由本實驗室細胞庫保存;VACV WR株由英國布里斯托大學Siddell教授惠贈。
胎牛血清(Sigma,美國);DMEM、胰蛋白酶(Gibco,美國);熒光探針DPH(用四氫呋喃配成2.0×10-3mol/L 母液,避光保存于-20℃,臨用前用PBS 稀釋)(Aldrich,美國);熒光探針DiBAC4(3)(用無水乙醇配成1 mg/mL 母液,避光保存于-20℃,臨用前用PBS 稀釋)(Molecular Probe,美國);單寧酸(浙江省溫州市甌海精細化工有限公司);中性紅(國藥集團化學試劑有限公司);SpectraMax M5 多功能酶標儀(美谷分子儀器公司,美國);FACSCalibur 流式細胞儀(BD公司,美國)。
實驗分為正常對照組、病毒組、單寧酸組、病毒加單寧酸組(病毒+單寧酸組)。病毒+單寧酸組分為先加入單寧酸后感染病毒(吸附前組)、先感染病毒后加入單寧酸(吸附后組)和感染病毒的同時加入單寧酸(吸附同時組)。
取對數(shù)生長期的Vero E6 細胞,按8×104/mL 濃度每孔200 μL接種于96孔板,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待長成單層細胞后,移去培養(yǎng)液上清,分別加入濃度為1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL 的含單寧酸維持液,每孔100 μL;培養(yǎng)24 h 后,采用中性紅比色法,在酶標儀上測定D492nm值,按下式計算細胞存活率,以Probit 回歸方法計算單寧酸半數(shù)中毒濃度(TC50)。各組均設4個復孔,實驗重復3次。
細胞存活率(%)=(試驗孔D492nm/對照孔D492nm)×100%
制備已長滿單層的96孔細胞培養(yǎng)板,使用單寧酸1~16 μg/mL,分別于病毒吸附前、吸附后及吸附同時干擾病毒感染細胞:①吸附前:單寧酸溶液100 μL/孔孵育1 h,棄液,PBS 洗滌,100 TCID50病毒液100 μL/孔吸附1 h;②吸附后:100 TCID50病毒液100 μL/孔吸附1 h,棄液,PBS 洗滌,加單寧酸溶液100 μL/孔孵育1 h;③吸附同時:將等體積的100 TCID50病毒液與單寧酸溶液混合后,于細胞培養(yǎng)板加混合液100 μL/孔,37℃孵育1 h。
將上述處理的細胞培養(yǎng)板內(nèi)液體吸棄,PBS 洗滌后加入維持培養(yǎng)基。設正常細胞對照孔和病毒對照孔,每天于倒置顯微鏡下觀察細胞變化。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后,用中性紅比色法檢測。各組均設4個復孔,實驗重復3次。
以Probit 回歸方法計算半數(shù)抑制濃度(IC50);按下式計算病毒抑制率:
病毒抑制率(%)=(藥物處理組D492nm-病毒對照組D492nm)/(細胞對照組D492nm-病毒對照組D492nm)×100%
按下式計算治療指數(shù)(TI):
在Vero E6 細胞(密度為2×106/mL)中加入100 TCID50的病毒液或16 μg/mL 單寧酸溶液進行孵育。正常對照組加入1 mL細胞維持液,病毒組加入1 mL病毒液,單寧酸組加入1 mL單寧酸溶液,吸附同時組加入1 mL病毒和單寧酸的等體積混合液,以上各組均于37℃孵育1 h。吸附前組先加1 mL 單寧酸溶液,37℃孵育1 h,PBS離洗后再加1 mL病毒液,37℃孵育1 h;吸附后組先加1 mL 病毒液,37℃孵育1 h,PBS洗滌后再加1 mL單寧酸溶液,37℃孵育1 h;孵育時須每15 min搖動混勻一次。
上述各組細胞懸液于1000 r/min離心5 min,棄上清,加入2×10-6μmol/mL DPH 熒光探針溶液1 mL,37℃孵育并不斷振蕩30 min,再用PBS 液洗一次,于激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長430 nm測定熒光各向異性(r)。r值越大,表示細胞膜流動性越??;反之,流動性越大。
細胞處理同1.5,細胞懸液1000 r/min 離心5 min,棄上清,加入0.1 μg/mL DiBAC4(3)熒光探針溶液1 mL,37℃孵育30 min 后上機測定,用未經(jīng)熒光物質(zhì)孵育的Vero E6 細胞調(diào)零。熒光增強,表示細胞膜電位絕對值減小,出現(xiàn)去極化變化;反之,熒光減弱,細胞膜電位絕對值增大,出現(xiàn)超極化變化。
應用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析,實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。組間比較采用方差分析,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
單寧酸對Vero E6細胞的毒性作用表現(xiàn)為細胞增殖緩慢、顆粒較多、折光性強。單寧酸對細胞的毒性作用隨著濃度的降低而逐漸減弱。中性紅比色法測得單寧酸TC50為81.0 μg/mL,TC0為16.0 μg/mL。
實驗結(jié)果見圖1,單寧酸對病毒的抑制作用隨著濃度的增加而增強。病毒吸附后加入單寧酸,病毒抑制率為18.7%~69.3%(IC50為8.7 μg/mL,TI 為9.3);病毒吸附同時加入單寧酸,病毒抑制率為11.7%~60.0%(IC50為13.1 μg/mL,TI為6.2)。
VACV感染后宿主細胞膜熒光各向異性顯著低于正常細胞對照組(P<0.05),說明病毒感染后宿主細胞膜流動性升高。單寧酸處理Vero E6細胞后熒光各向異性與正常對照組接近,說明單寧酸對正常細胞膜流動性無明顯影響。3 種加入方式中,單寧酸在病毒吸附前和病毒吸附后作用,均可使熒光各向異性升高,其中吸附后組與正常對照組比較有顯著性差異(P<0.01),說明單寧酸在VACV 吸附后作用可降低宿主細胞膜流動性(表1)。
VACV感染Vero E6細胞后,熒光強度顯著低于正常細胞對照組(P<0.01),說明病毒感染后宿主細胞膜處于超極化狀態(tài)。單寧酸作用于Vero E6細胞后,熒光強度顯著低于正常細胞對照組(P<0.01),說明單寧酸作用同樣使細胞膜處于超極化狀態(tài)。單寧酸3種處理方式下,VACV吸附各組的熒光強度值與病毒對照組比較無顯著性差異,說明單寧酸不同處理方式對VACV感染各組中膜電位的變化無明顯干預作用(表2)。
單寧酸是相對分子質(zhì)量為500~3000 的天然酚類化合物,在自然界分布廣泛,因其具有多酚羥基結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出獨特的化學特性和生理活性。VACV是只在靶細胞的胞漿中復制的雙鏈DNA(dsDNA)病毒。成熟的病毒粒子呈橢圓形或磚形,外層有較厚的囊膜包裹,其囊膜含有多種病毒蛋白。病毒感染和復制的過程包括3個步驟:①病毒的吸附、侵入和脫殼;②基因組的轉(zhuǎn)錄和復制;③病毒的組裝、成熟和釋放。本實驗中,單寧酸以不同加入方式干擾病毒感染細胞,結(jié)果顯示,單寧酸以病毒吸附后及病毒吸附同時2種方式加入時,可有效抑制VACV 感染,于吸附前孵育細胞對VACV 侵入細胞無阻斷作用,提示單寧酸抑制VACV感染的機制可能存在于病毒吸附同時和吸附后。
圖1 單寧酸不同加入方式抑制VACV感染效果(,n=3)
病毒的感染首先依賴于病毒吸附蛋白對細胞表面受體的吸附,隨后發(fā)生的侵入也同病毒感染成功與否密切相關(guān),這些環(huán)節(jié)均涉及病毒與細胞膜的相互作用。細胞膜脂質(zhì)和脂蛋白質(zhì)都有一定的流動性,細胞膜流動性的改變可影響病毒吸附和侵入細胞[9-10]。如吩噻嗪通過增強細胞膜流動性從而達到抑制丙型肝炎病毒(HCV)與細胞膜融合的效果[11];而Harada 等發(fā)現(xiàn),在病毒吸附同時和吸附后2 個階段,細胞膜流動性的升高都可以增加人免疫缺陷病毒(HIV)感染率[12]。有研究表明,植物多酚可嵌入細胞脂質(zhì)雙層膜的表層,影響細胞膜生物學特性[13]。本研究結(jié)果顯示,單寧酸對正常細胞膜流動性無明顯影響,而VACV 感染后宿主細胞膜流動性顯著升高。3 種不同加入方式中,只有在感染后加入單寧酸,可以干預病毒感染對細胞膜的影響,細胞膜流動性顯著低于正常對照組。提示單寧酸抑制病毒感染可能存在以下機制:VACV 感染后細胞膜流動性的增加易于單寧酸嵌入脂質(zhì)雙層膜,致使細胞膜流動性顯著降低,膜流動性的降低干擾了VACV 入胞過程,從而抑制病毒感染。
細胞膜是病毒侵入細胞的第一道重要防線,膜電位是細胞膜重要的生物物理特性。從病毒吸附蛋白與細胞受體特異性結(jié)合到內(nèi)吞入胞,病毒侵入細胞是一個能量依賴的過程。研究表明,脊髓灰質(zhì)炎病毒和人鼻病毒侵入宿主細胞過程涉及細胞膜電位變化,細胞膜跨膜電位差是促使病毒內(nèi)化的能態(tài)之一[14-15]。本實驗結(jié)果表明,VACV 感染Vero E6 細胞后,可使細胞膜發(fā)生超極化,形成局部電流,跨膜電位差利于病毒穿入靶細胞內(nèi)。單寧酸亦使細胞膜處于超極化狀態(tài),并不能有效降低病毒感染引起的細胞超極化現(xiàn)象,說明對病毒借助跨膜電位差進入宿主細胞這一過程無顯著干預作用,由此我們推測單寧酸抑制病毒感染的作用機制可能與此環(huán)節(jié)無關(guān)。
表1 單寧酸對VACV感染后細胞膜流動性變化的干預作用(,n=3)
表1 單寧酸對VACV感染后細胞膜流動性變化的干預作用(,n=3)
與正常對照組比較,aP<0.05,bP<0.01
表2 單寧酸對VACV感染后細胞膜電位變化的干預作用(,n=3)
表2 單寧酸對VACV感染后細胞膜電位變化的干預作用(,n=3)
與正常對照組比較,aP<0.01
綜上所述,單寧酸在體外有較強的抑制痘苗病毒感染的作用,其作用機制可能與干預細胞膜流動性有關(guān),具體作用靶點還有待進一步研究。
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