李鑫，黑多爾，劉巖，張寅寅

遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001

蘋果牛眼果腐病（bull's eye rot on apple）由明孢盤菌屬的3個(gè)致病種（Neofabraea perennans、N.malicorticis、N.alba）引起[1]，是我國對外一類檢疫對象[2]。蘋果牛眼果腐病主要依靠進(jìn)境水果傳播蔓延，目前對蘋果牛眼果腐病菌的檢疫鑒定，一般采用常規(guī)PCR 和測序同時(shí)進(jìn)行判定[3]，雖然準(zhǔn)確率較高，但整個(gè)檢測周期最少在10 d 左右，有時(shí)甚至長達(dá)20 d，而根據(jù)《中華人民共和國進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫法》[4]規(guī)定，進(jìn)境貨物在實(shí)驗(yàn)室出具檢驗(yàn)檢疫結(jié)果之前，該批貨物不得銷售、使用，因此，較長的檢測周期嚴(yán)重影響了貨物的通關(guān)速度，甚至?xí)o貨主帶來不必要的經(jīng)濟(jì)損失。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是近年發(fā)展迅速的一種快速檢測方法，其相較于PCR 的最大優(yōu)勢在于檢測時(shí)間大大縮短，檢測結(jié)果肉眼可見，檢測特異性提高2 個(gè)數(shù)量級，且擴(kuò)增階段對儀器要求低[5]。因此，研發(fā)適用于蘋果牛眼果腐病菌3 個(gè)致病種的LAMP檢測法，實(shí)用方便，可應(yīng)用推廣于檢測一線，并能很好地解決快速通關(guān)與提高檢出率并行的難題。

1 材料與方法

1.1 材料

N.perennans（ATCC26206）和N.malicorticis（ATCC13903）購自美國菌種保藏中心（ATCC）；N.alba由廣東檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心王衛(wèi)芳研究員饋贈(zèng)。

LAMP DNA 擴(kuò)增試劑盒購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司；DNA提取試劑盒為Omega微量DNA提取試劑盒；其余普通分子生物學(xué)試劑均購自大連寶生物公司。LAMP實(shí)時(shí)濁度儀為日本榮研LA-320c。

1.2 明孢盤菌屬3個(gè)致病種LAMP通用引物設(shè)計(jì)

LAMP 引物設(shè)計(jì)主要針對靶基因的6 個(gè)不同區(qū)域，即基于靶基因3'端的F3c、F2c 和Flc 區(qū)及5'端的Bl、B2和B3區(qū)等6個(gè)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物。

本研究根據(jù)明孢盤菌屬特異性β-tublin基因和真菌通用引物ITS序列作為靶序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.3 最佳引物篩選

1.3.1 LAMP 反應(yīng)體系的配制 1 次反應(yīng)量反應(yīng)體系包括：2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL，引物FIP 1.0 μL（40 pmol）、BIP 1.0 μL（40 pmol）、F3 1.0 μL（5 pmol）、B3 1.0 μL（5 pmol），BstDNA 聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，去離子水5.5 μL，總體積25.0 μL。分裝入另行準(zhǔn)備的預(yù)混溶液配制用滅菌管中（在冰上進(jìn)行）。

向Loopamp（R）反應(yīng)試管中分別加入上述樣本反應(yīng)及對照反應(yīng)所需的預(yù)混溶液各23 μL，添加模板DNA 2 μL，使總量達(dá)25 μL；陰性對照反應(yīng)用去離子水2 μL代替樣品DNA。

1.3.2 陽性對照反應(yīng) 使用陽性對照DNA（PC DNA）2 μL。用移液器吸排液法將2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL、引物溶液DNA 2.5 μL、BstDNA 聚合酶1.0 μL、陽性對照DNA2.0 μL、去離子水7.0 μL（總體積25.0 μL）混合，或合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時(shí)離心。混合時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡。預(yù)混溶液和樣本溶液的混合在冰上進(jìn)行。

1.3.3 反應(yīng)條件 將已配制好、分裝完畢的反應(yīng)試管置于LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀（已與電腦連接）中，根據(jù)儀器操作說明書設(shè)定反應(yīng)條件：65℃恒溫30～60 min，80℃恒溫5 min 或95℃恒溫2 min，使酶滅活以終止反應(yīng)。

1.4 特異性引物反應(yīng)最佳溫度的篩選

采用上述得到的特異性引物，在相同體系條件下進(jìn)行LAMP最佳溫度篩選試驗(yàn)。反應(yīng)體系及操作步驟同1.3，設(shè)計(jì)梯度溫度依次為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，其他反應(yīng)條件不變，根據(jù)擴(kuò)增效率篩選出引物反應(yīng)的最佳溫度。

2 結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)β-tublin基因設(shè)計(jì)出2 組引物組合①、②，根據(jù)ITS 序列設(shè)計(jì)出1 組引物組合③。每組引物包括外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP，灰底突顯為差異基因。

引物組合①：

引物組合②：

引物組合③：

2.2 LAMP法最佳特異性引物的篩選結(jié)果

將設(shè)計(jì)的3 組引物分別與3 個(gè)DNA 樣品進(jìn)行LAMP反應(yīng)，分別設(shè)置陽性對照及陰性對照。

2.2.1 引物組合①擴(kuò)增結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明陽性對照有擴(kuò)增，而本研究中所采用的引物組合①對目標(biāo)菌均無特異性擴(kuò)增，表明該引物組合對明孢盤菌屬真菌的無特異性（圖1）。

2.2.2 引物組合②擴(kuò)增結(jié)果 從圖2 可看出，除陽性對照外，N.alba有擴(kuò)增，其余參試菌株無擴(kuò)增，表明該引物組合不適合作為明孢盤菌屬真菌的特異性引物。

2.2.3 引物組合③擴(kuò)增結(jié)果 LAMP 驗(yàn)證試驗(yàn)表明引物組合③可以特異性擴(kuò)增出N.malicorticis、N.perennans、N.alba這3 種參試目標(biāo)菌株，且陽性對照正常有擴(kuò)增，陰性對照無特異性擴(kuò)增，表明該引物組合針對明孢盤菌屬3個(gè)致病種的特異性較好（圖3）。

圖1 引物組合①擴(kuò)增結(jié)果

圖2 引物組合②擴(kuò)增結(jié)果

2.2.4 特異性引物反應(yīng)最佳溫度篩選 以N.alba種DNA 作為靶序列，進(jìn)行LAMP 反應(yīng)最佳溫度梯度實(shí)驗(yàn)，6 條擴(kuò)增曲線見圖4。結(jié)果表明，當(dāng)擴(kuò)增溫度逐漸升高時(shí)，擴(kuò)增效率隨之升高，當(dāng)擴(kuò)增溫度達(dá)到64℃時(shí)，溫度的增加并未對擴(kuò)增效率有明顯影響，因此，將64℃作為最佳反應(yīng)溫度。

圖3 引物組合③擴(kuò)增結(jié)果

圖4 不同溫度下的擴(kuò)增效率

3 討論

蘋果牛眼果腐病在歐美蘋果產(chǎn)區(qū)存在歷史長達(dá)百年，此病有“蘋果樹癌癥”之稱，一旦發(fā)生很難控制。2009年，我國廣東口岸首次截獲該病菌[6]，之前在國內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。針對該病的檢疫鑒定方法多采用真菌通用引物擴(kuò)增后測序的方式，檢測周期頗為漫長。2012年，筆者曾針對引起蘋果牛眼果腐病菌的3 個(gè)致病種研發(fā)了其通用引物，經(jīng)驗(yàn)證特異性較好[3]。此次，本研究再次針對該病的3個(gè)致病種進(jìn)行LAMP引物的設(shè)計(jì)，旨在建立更高效、特異的適用于口岸檢測的LAMP 檢測方法。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，通過真菌通用引物ITS序列設(shè)計(jì)的LAMP引物組合③，對明孢盤菌屬的3 個(gè)致病種可產(chǎn)生特異性的擴(kuò)增，且最佳反應(yīng)溫度為64℃。

本研究建立的LAMP檢測蘋果牛眼果腐病菌的技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。該方法的研發(fā)簡化了蘋果牛眼果腐病的檢驗(yàn)檢疫過程，提高了通關(guān)效率，為縮短檢測時(shí)限創(chuàng)造了良好的理論基礎(chǔ)。

[1]Henriquez J L,Sugar D.Etiology of bull's eye rot of pear caused by Neofabraea spp.in Oregon,Washington,and California[J].Plant Dis,2004,88:1134-1138.

[2]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部、質(zhì)檢總局.中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄[Z].2007-05-28.

[3]李鑫,曹際娟,王有福,等.PCR 檢測引發(fā)蘋果牛眼果腐病的明孢盤菌屬的三個(gè)致病種[J].植物檢疫,2013,27(3):75-79.

[4]全國人大常委會(huì).中華人民共和國進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫法[Z].1991-10-30.

[5]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):e63.

[6]王衛(wèi)芳,胡佳,張永瑜,等.廣東口岸首次截獲美國蘋果牛眼果腐病[J].植物檢疫,2010,24(1):35-37.