趙海衛(wèi) ，韓佩君，姚敏，呂欣，雷迎峰，楊敬，喬卿華，翁代慧，黨品香，尹文

第四軍醫(yī)大學(xué) a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部微生物學(xué)教研室；b.西京醫(yī)院輸血科；陜西 西安 710032

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引起慢性肝病的主要病原體之一，目前全球至少有1.7億感染者。持續(xù)HCV 感染會引起肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，至今尚無有效的預(yù)防性疫苗，干擾素聯(lián)合利巴韋林的標(biāo)準(zhǔn)療法雖有一定效果但仍有缺陷[1-2]。HCV 為單股正鏈RNA 病毒，屬于黃病毒科肝炎病毒屬，基因組全長9.6 kb，編碼10 個病毒蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白（Core、E1、E2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[3]。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B聚集在感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上形成復(fù)合物（復(fù)制復(fù)合體），為病毒RNA 的復(fù)制提供了穩(wěn)定的微環(huán)境[4-6]。NS3 具有絲氨酸蛋白酶和RNA 解螺旋酶的雙重活性，前者在病毒前體蛋白成熟過程中發(fā)揮切割不同非結(jié)構(gòu)蛋白的功能，后者在病毒RNA 復(fù)制中發(fā)揮解螺旋功能[7-8]。NS4A 作為NS3 蛋白酶活性的輔因子，與NS3 結(jié)合并輔助其錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[9]。NS4B 和NS5A 是病毒RNA 纏繞蛋白，是復(fù)制復(fù)合體形成的重要結(jié)構(gòu)成分，并參與誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜改變[4,10-11]。NS5B，即RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），是病毒RNA 復(fù)制過程中的關(guān)鍵酶，已經(jīng)成為抗HCV 治療的重要靶點之一[12]。最近，已有HCV RdRp 抑制劑（Sofosbuvir）獲準(zhǔn)上市，該藥治療效果顯著，但成本高昂、臨床監(jiān)測復(fù)雜使其難以被推廣使用[13]。缺乏表達(dá)RdRp 酶活性的體內(nèi)試驗?zāi)Ｐ褪荋CV RdRp抑制劑研發(fā)緩慢的主要原因。

實際上，NS5B 蛋白雖是HCV RNA 復(fù)制過程中最關(guān)鍵的酶，但并不能僅依靠其單獨完成HCV 復(fù)制的整個過程，還需非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4A、NS4B 和NS5A的輔助。HCV RNA的復(fù)制是在其非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜所形成的復(fù)制復(fù)合體中進(jìn)行的，因此，只有在HCV 復(fù)制復(fù)合體中才能更加真實地模擬HCV感染中RdRp酶的活性[6]。

我們前期已構(gòu)建了表達(dá)HCV NS3-5B蛋白的體外模型[14]，但細(xì)胞環(huán)境并不能完全真實地模擬病毒感染宿主時機(jī)體的復(fù)雜內(nèi)環(huán)境，與在體實驗相比還存在一定的局限性。因此，本研究以質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B為基礎(chǔ)，構(gòu)建表達(dá)HCV NS3-5B蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，建立HCV 復(fù)制復(fù)合體的在體模型，為HCV感染中RdRp酶活性的評價提供研究平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型C57BL/6 小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供；質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B[14]由本室構(gòu)建；基因組DNA 提取試劑盒購自天根公司；PCR 試劑、DNA marker 和預(yù)染蛋白marker 均購自TaKaRa公司；TRIzol 總RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen 公司；RIPA 裂解液（強(qiáng)）購自碧云天公司；抗HCV NS5B 小鼠單克隆抗體由本實驗室制備；抗HCV NS3/4A 小鼠單克隆抗體和抗β-actin小鼠單克隆抗體均購自Abcam 公司；紅外標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗購自LI-COR 公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計與合成

以pJ6/JFH-1（GenBank：AB114136.1）基因序列和β-actin（GenBank：NM001244575）基因序列為模板，相關(guān)引物設(shè)計如表1，所有引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.3 目的基因線性化及受精卵顯微注射

質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 經(jīng)EcoRⅠ酶切，其線性化基因片段作為受精卵注射目的基因。瓊脂糖凝膠電泳純化目的基因，以野生型C57BL/6 雌性小鼠為實驗對象，按照常規(guī)方法進(jìn)行受精卵顯微注射和胚胎移植[15]。

1.4 首建鼠的鑒定

4 周齡小鼠，剪取鼠尾1～2 cm，提取組織DNA，PCR 對HCV NS3 和NS5B 基因片段分別進(jìn)行鑒定（擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s、58℃30s、72℃2 min，共30 個循環(huán)），PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定；初鑒完成后，對鑒定陽性的小鼠，再通過PCR 進(jìn)行NS3-5B 全長基因片段復(fù)鑒，上游引物為NS3引物F1，下游引物為NS5B 引物R2，反應(yīng)條件為98℃10 s、68℃7 min，共30個循環(huán)，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。初鑒與復(fù)鑒均陽性者為轉(zhuǎn)基因首建鼠。

表1 引物及序列

1.5 轉(zhuǎn)基因小鼠傳代與篩選

將轉(zhuǎn)基因首建鼠與野生型C57BL/6 小鼠交配，子代小鼠鑒定方法與首建鼠鑒定方法相同，篩選出F1代轉(zhuǎn)基因小鼠；將F1代轉(zhuǎn)基因小鼠繼續(xù)與野生型C57BL/6小鼠交配，鑒定并篩選出F2代轉(zhuǎn)基因小鼠，同樣方法傳代并篩選至F5 代轉(zhuǎn)基因小鼠；將F5 代雌雄轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配，鑒定并篩選出遺傳性狀穩(wěn)定的純合子轉(zhuǎn)基因小鼠，將純合子轉(zhuǎn)基因小鼠繼續(xù)繁育。

1.6 RT-PCR檢測

用TRIzol 總RNA 提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織總RNA，測定RNA 的濃度，按RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，分別擴(kuò)增NS3、NS5B（擴(kuò)增條件同前）和內(nèi)參βactin 基因片段（擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，共30 個循環(huán)），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定。

1.7 Western印跡

用RIPA 裂解液提取C57BL/6 小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的肝組織總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg總蛋白樣品，變性后經(jīng)SDS-PAGE，電泳完成后將膠中蛋白條帶轉(zhuǎn)移至經(jīng)甲醇浸泡過的PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉PVDF 膜2 h；加入用TBST 稀釋的抗HCV NS3/4A 小鼠單克隆抗體（1∶1000）、抗HCV NS5B小鼠單克隆抗體（1∶500）和抗β-actin 小鼠單克隆抗體（1∶1000），4℃搖床過夜；TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入TBST 稀釋的紅外標(biāo)記二抗，避光室溫孵育2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min，Odyssey紅外成像儀成像。

1.8 血清轉(zhuǎn)氨酶檢測

分別對6 周齡的10 只野生型C57BL/6 雄性小鼠和10 只純合子轉(zhuǎn)基因雄性小鼠摘眼球采血，分離血清檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）。

1.9 病理學(xué)檢查

取6 周齡純合子轉(zhuǎn)基因小鼠的肝組織，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片后做HE染色，分析組織病理形態(tài)。野生型C57BL/6小鼠為正常對照。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05 為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B的構(gòu)建及線性化

質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 示意圖見圖1，NS3-5B 基因片段在EcoRⅠ和BglⅡ位點與載體pIRES2-EGFP 連接。質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B經(jīng)EcoRⅠ酶切，其線性化目的基因片段大小為11 315 bp，電泳結(jié)果可見預(yù)期大小的目的基因（圖2）。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定

轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)PCR 擴(kuò)增電泳鑒定，NS3 基因片段為1893 bp（圖3），NS5B 基因片段為1772 bp（圖4）；NS3 和NS5B 鑒定均陽性的小鼠的NS3-5B 全長基因為6009 bp（圖5）。NS3-5B 全長基因鑒定結(jié)果與NS3和NS5B基因鑒定結(jié)果一致，且目的基因片段大小與其實際大小相符。

圖1 質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B示意圖

圖2 質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B酶切線性化

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠NS3基因PCR擴(kuò)增鑒定

2.3 RT-PCR 和Western 印跡檢測轉(zhuǎn)基因小鼠目的基因的表達(dá)

RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中NS3和NS5B基因mRNA 的表達(dá)（圖6A），在肝組織中檢測到目的基因，大小與預(yù)期一致；Western 印跡檢測轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織NS3/4A 和NS5B 蛋白的表達(dá)（圖6B），在肝組織中檢測到目的蛋白，大小與預(yù)期一致。

圖4 轉(zhuǎn)基因小鼠NS5B基因PCR擴(kuò)增鑒定

圖5 轉(zhuǎn)基因小鼠NS3-5B基因PCR擴(kuò)增鑒定

圖6 轉(zhuǎn)基因小鼠目的基因的表達(dá)

2.4 肝功能評價

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Levene 方差齊性檢驗和近似t檢驗分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小鼠ALT 值和AST 值與野生型C57BL/6 小鼠相比無顯著性差別（P＞0.05，表2），尚不能認(rèn)為HCV NS3-5B 蛋白對小鼠肝臟有損傷。ALT和AST檢測結(jié)果如圖7所示。

2.5 組織形態(tài)分析

HE 染色結(jié)果表明6 周齡轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織與野生型小鼠肝組織相比無形態(tài)學(xué)差異（圖8）。

3 討論

自HCV 被發(fā)現(xiàn)以來，研究者一直致力于抗HCV藥物研發(fā)，但目前HCV 感染的預(yù)防與治療仍然是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大難題。傳統(tǒng)的治療方法是聚乙二醇干擾素加利巴韋林聯(lián)合治療，但其對某些亞型HCV 的治療效果不佳，且易產(chǎn)生副作用[16]。NS5B 是由病毒自身編碼的、在HCV RNA 復(fù)制過程中起關(guān)鍵作用的RNA聚合酶，目前被認(rèn)為是抗HCV治療的理想靶點之一[12]。實踐也證實RdRp 抑制劑（Sofosbuvir）治療HCV感染效果顯著[13]，但由于缺乏有效模擬RdRp酶活性的模型，極大地阻礙了RdRp 抑制劑的研發(fā)。HCV 感染機(jī)體時，病毒RNA 的復(fù)制是在其非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成的復(fù)制復(fù)合體中完成的，因此，只有在復(fù)制復(fù)合體中才能更加真實地模擬HCV復(fù)制過程中RdRp 酶的活性。我們通過顯微注射法將質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 導(dǎo)入小鼠受精卵中，構(gòu)建了HCV NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)一系列鑒定，證實該轉(zhuǎn)基因小鼠目的基因成功表達(dá)，建立了HCV 復(fù)制復(fù)合體在體模型。

表2 ALT和AST相關(guān)參數(shù)（）

表2 ALT和AST相關(guān)參數(shù)（）

TG組為轉(zhuǎn)基因小鼠；WT組為野生型C57BL/6小鼠

圖7 野生小鼠與轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST測定值

圖8 野生小鼠與轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織HE染色（×200）

目前，已證實非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B 共同參與完成HCV RNA 的復(fù)制，但其是否直接參與損傷肝組織尚無定論。本研究對6周齡轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT 和AST 進(jìn)行了檢測，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果與正常小鼠相比無顯著性差異，尚不能認(rèn)為6 周齡轉(zhuǎn)基因小鼠HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白會損傷肝臟；但從其散點圖（圖7）離散趨勢可知部分轉(zhuǎn)基因小鼠ALT 值和AST 值較高，初步考慮可能與個體之間目的基因拷貝數(shù)不同有關(guān)。之前有研究發(fā)現(xiàn)6 月齡以上的HCV NS5A轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織才會出現(xiàn)一定程度的病理改變，說明非結(jié)構(gòu)蛋白對肝組織的損傷程度與其持續(xù)作用時間有關(guān)[17]。本研究中HE 染色未發(fā)現(xiàn)6 周齡NS3-5B 轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織有任何形態(tài)改變，可能非結(jié)構(gòu)蛋白對肝組織的作用時間較短，尚未造成病理變化。

綜上，我們構(gòu)建了表達(dá)HCV NS3-5B 蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為HCV 感染中RdRp 酶活性的評價及其抑制劑的篩選提供了研究平臺。我們后續(xù)將通過對轉(zhuǎn)基因小鼠目的基因拷貝數(shù)、非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)量和生長周期等因素的研究，探討HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白與肝組織損傷的關(guān)系，并進(jìn)一步構(gòu)建用于RdRp酶抑制劑篩選的動物模型。

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