趙海衛(wèi) ,韓佩君,姚敏,呂欣,雷迎峰,楊敬,喬卿華,翁代慧,黨品香,尹文
第四軍醫(yī)大學 a.基礎(chǔ)醫(yī)學部微生物學教研室;b.西京醫(yī)院輸血科;陜西 西安 710032
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是引起慢性肝病的主要病原體之一,目前全球至少有1.7億感染者。持續(xù)HCV 感染會引起肝纖維化、肝硬化,甚至肝癌,至今尚無有效的預(yù)防性疫苗,干擾素聯(lián)合利巴韋林的標準療法雖有一定效果但仍有缺陷[1-2]。HCV 為單股正鏈RNA 病毒,屬于黃病毒科肝炎病毒屬,基因組全長9.6 kb,編碼10 個病毒蛋白,包括結(jié)構(gòu)蛋白(Core、E1、E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[3]。其中,非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B聚集在感染細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上形成復(fù)合物(復(fù)制復(fù)合體),為病毒RNA 的復(fù)制提供了穩(wěn)定的微環(huán)境[4-6]。NS3 具有絲氨酸蛋白酶和RNA 解螺旋酶的雙重活性,前者在病毒前體蛋白成熟過程中發(fā)揮切割不同非結(jié)構(gòu)蛋白的功能,后者在病毒RNA 復(fù)制中發(fā)揮解螺旋功能[7-8]。NS4A 作為NS3 蛋白酶活性的輔因子,與NS3 結(jié)合并輔助其錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[9]。NS4B 和NS5A 是病毒RNA 纏繞蛋白,是復(fù)制復(fù)合體形成的重要結(jié)構(gòu)成分,并參與誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜改變[4,10-11]。NS5B,即RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp),是病毒RNA 復(fù)制過程中的關(guān)鍵酶,已經(jīng)成為抗HCV 治療的重要靶點之一[12]。最近,已有HCV RdRp 抑制劑(Sofosbuvir)獲準上市,該藥治療效果顯著,但成本高昂、臨床監(jiān)測復(fù)雜使其難以被推廣使用[13]。缺乏表達RdRp 酶活性的體內(nèi)試驗?zāi)P褪荋CV RdRp抑制劑研發(fā)緩慢的主要原因。
實際上,NS5B 蛋白雖是HCV RNA 復(fù)制過程中最關(guān)鍵的酶,但并不能僅依靠其單獨完成HCV 復(fù)制的整個過程,還需非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4A、NS4B 和NS5A的輔助。HCV RNA的復(fù)制是在其非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜所形成的復(fù)制復(fù)合體中進行的,因此,只有在HCV 復(fù)制復(fù)合體中才能更加真實地模擬HCV感染中RdRp酶的活性[6]。
我們前期已構(gòu)建了表達HCV NS3-5B蛋白的體外模型[14],但細胞環(huán)境并不能完全真實地模擬病毒感染宿主時機體的復(fù)雜內(nèi)環(huán)境,與在體實驗相比還存在一定的局限性。因此,本研究以質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B為基礎(chǔ),構(gòu)建表達HCV NS3-5B蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠,建立HCV 復(fù)制復(fù)合體的在體模型,為HCV感染中RdRp酶活性的評價提供研究平臺。
野生型C57BL/6 小鼠由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供;質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B[14]由本室構(gòu)建;基因組DNA 提取試劑盒購自天根公司;PCR 試劑、DNA marker 和預(yù)染蛋白marker 均購自TaKaRa公司;TRIzol 總RNA 提取試劑盒、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen 公司;RIPA 裂解液(強)購自碧云天公司;抗HCV NS5B 小鼠單克隆抗體由本實驗室制備;抗HCV NS3/4A 小鼠單克隆抗體和抗β-actin小鼠單克隆抗體均購自Abcam 公司;紅外標記兔抗鼠IgG 二抗購自LI-COR 公司;其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
以pJ6/JFH-1(GenBank:AB114136.1)基因序列和β-actin(GenBank:NM001244575)基因序列為模板,相關(guān)引物設(shè)計如表1,所有引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成。
質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 經(jīng)EcoRⅠ酶切,其線性化基因片段作為受精卵注射目的基因。瓊脂糖凝膠電泳純化目的基因,以野生型C57BL/6 雌性小鼠為實驗對象,按照常規(guī)方法進行受精卵顯微注射和胚胎移植[15]。
4 周齡小鼠,剪取鼠尾1~2 cm,提取組織DNA,PCR 對HCV NS3 和NS5B 基因片段分別進行鑒定(擴增條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃30 s、58℃30s、72℃2 min,共30 個循環(huán)),PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定;初鑒完成后,對鑒定陽性的小鼠,再通過PCR 進行NS3-5B 全長基因片段復(fù)鑒,上游引物為NS3引物F1,下游引物為NS5B 引物R2,反應(yīng)條件為98℃10 s、68℃7 min,共30個循環(huán),PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。初鑒與復(fù)鑒均陽性者為轉(zhuǎn)基因首建鼠。
表1 引物及序列
將轉(zhuǎn)基因首建鼠與野生型C57BL/6 小鼠交配,子代小鼠鑒定方法與首建鼠鑒定方法相同,篩選出F1代轉(zhuǎn)基因小鼠;將F1代轉(zhuǎn)基因小鼠繼續(xù)與野生型C57BL/6小鼠交配,鑒定并篩選出F2代轉(zhuǎn)基因小鼠,同樣方法傳代并篩選至F5 代轉(zhuǎn)基因小鼠;將F5 代雌雄轉(zhuǎn)基因小鼠進行交配,鑒定并篩選出遺傳性狀穩(wěn)定的純合子轉(zhuǎn)基因小鼠,將純合子轉(zhuǎn)基因小鼠繼續(xù)繁育。
用TRIzol 總RNA 提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織總RNA,測定RNA 的濃度,按RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;以cDNA為模板,分別擴增NS3、NS5B(擴增條件同前)和內(nèi)參βactin 基因片段(擴增條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃30 s、58℃30 s、72℃30 s,共30 個循環(huán)),擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定。
用RIPA 裂解液提取C57BL/6 小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的肝組織總蛋白,BCA 法進行蛋白定量。取50 μg總蛋白樣品,變性后經(jīng)SDS-PAGE,電泳完成后將膠中蛋白條帶轉(zhuǎn)移至經(jīng)甲醇浸泡過的PVDF 膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉PVDF 膜2 h;加入用TBST 稀釋的抗HCV NS3/4A 小鼠單克隆抗體(1∶1000)、抗HCV NS5B小鼠單克隆抗體(1∶500)和抗β-actin 小鼠單克隆抗體(1∶1000),4℃搖床過夜;TBST 洗膜3 次,每次5 min,加入TBST 稀釋的紅外標記二抗,避光室溫孵育2 h;TBST 洗膜3 次,每次5 min,Odyssey紅外成像儀成像。
分別對6 周齡的10 只野生型C57BL/6 雄性小鼠和10 只純合子轉(zhuǎn)基因雄性小鼠摘眼球采血,分離血清檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。
取6 周齡純合子轉(zhuǎn)基因小鼠的肝組織,用4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片后做HE染色,分析組織病理形態(tài)。野生型C57BL/6小鼠為正常對照。
用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,P<0.05 為差別有統(tǒng)計學意義。
質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 示意圖見圖1,NS3-5B 基因片段在EcoRⅠ和BglⅡ位點與載體pIRES2-EGFP 連接。質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B經(jīng)EcoRⅠ酶切,其線性化目的基因片段大小為11 315 bp,電泳結(jié)果可見預(yù)期大小的目的基因(圖2)。
轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)PCR 擴增電泳鑒定,NS3 基因片段為1893 bp(圖3),NS5B 基因片段為1772 bp(圖4);NS3 和NS5B 鑒定均陽性的小鼠的NS3-5B 全長基因為6009 bp(圖5)。NS3-5B 全長基因鑒定結(jié)果與NS3和NS5B基因鑒定結(jié)果一致,且目的基因片段大小與其實際大小相符。
圖1 質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B示意圖
圖2 質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B酶切線性化
圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠NS3基因PCR擴增鑒定
RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中NS3和NS5B基因mRNA 的表達(圖6A),在肝組織中檢測到目的基因,大小與預(yù)期一致;Western 印跡檢測轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織NS3/4A 和NS5B 蛋白的表達(圖6B),在肝組織中檢測到目的蛋白,大小與預(yù)期一致。
圖4 轉(zhuǎn)基因小鼠NS5B基因PCR擴增鑒定
圖5 轉(zhuǎn)基因小鼠NS3-5B基因PCR擴增鑒定
圖6 轉(zhuǎn)基因小鼠目的基因的表達
實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Levene 方差齊性檢驗和近似t檢驗分析,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小鼠ALT 值和AST 值與野生型C57BL/6 小鼠相比無顯著性差別(P>0.05,表2),尚不能認為HCV NS3-5B 蛋白對小鼠肝臟有損傷。ALT和AST檢測結(jié)果如圖7所示。
HE 染色結(jié)果表明6 周齡轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織與野生型小鼠肝組織相比無形態(tài)學差異(圖8)。
自HCV 被發(fā)現(xiàn)以來,研究者一直致力于抗HCV藥物研發(fā),但目前HCV 感染的預(yù)防與治療仍然是醫(yī)學領(lǐng)域的一大難題。傳統(tǒng)的治療方法是聚乙二醇干擾素加利巴韋林聯(lián)合治療,但其對某些亞型HCV 的治療效果不佳,且易產(chǎn)生副作用[16]。NS5B 是由病毒自身編碼的、在HCV RNA 復(fù)制過程中起關(guān)鍵作用的RNA聚合酶,目前被認為是抗HCV治療的理想靶點之一[12]。實踐也證實RdRp 抑制劑(Sofosbuvir)治療HCV感染效果顯著[13],但由于缺乏有效模擬RdRp酶活性的模型,極大地阻礙了RdRp 抑制劑的研發(fā)。HCV 感染機體時,病毒RNA 的復(fù)制是在其非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成的復(fù)制復(fù)合體中完成的,因此,只有在復(fù)制復(fù)合體中才能更加真實地模擬HCV復(fù)制過程中RdRp 酶的活性。我們通過顯微注射法將質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 導入小鼠受精卵中,構(gòu)建了HCV NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠,經(jīng)一系列鑒定,證實該轉(zhuǎn)基因小鼠目的基因成功表達,建立了HCV 復(fù)制復(fù)合體在體模型。
表2 ALT和AST相關(guān)參數(shù)()
表2 ALT和AST相關(guān)參數(shù)()
TG組為轉(zhuǎn)基因小鼠;WT組為野生型C57BL/6小鼠
圖7 野生小鼠與轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST測定值
圖8 野生小鼠與轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織HE染色(×200)
目前,已證實非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B 共同參與完成HCV RNA 的復(fù)制,但其是否直接參與損傷肝組織尚無定論。本研究對6周齡轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT 和AST 進行了檢測,統(tǒng)計學分析結(jié)果與正常小鼠相比無顯著性差異,尚不能認為6 周齡轉(zhuǎn)基因小鼠HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白會損傷肝臟;但從其散點圖(圖7)離散趨勢可知部分轉(zhuǎn)基因小鼠ALT 值和AST 值較高,初步考慮可能與個體之間目的基因拷貝數(shù)不同有關(guān)。之前有研究發(fā)現(xiàn)6 月齡以上的HCV NS5A轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織才會出現(xiàn)一定程度的病理改變,說明非結(jié)構(gòu)蛋白對肝組織的損傷程度與其持續(xù)作用時間有關(guān)[17]。本研究中HE 染色未發(fā)現(xiàn)6 周齡NS3-5B 轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織有任何形態(tài)改變,可能非結(jié)構(gòu)蛋白對肝組織的作用時間較短,尚未造成病理變化。
綜上,我們構(gòu)建了表達HCV NS3-5B 蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,為HCV 感染中RdRp 酶活性的評價及其抑制劑的篩選提供了研究平臺。我們后續(xù)將通過對轉(zhuǎn)基因小鼠目的基因拷貝數(shù)、非結(jié)構(gòu)蛋白表達量和生長周期等因素的研究,探討HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白與肝組織損傷的關(guān)系,并進一步構(gòu)建用于RdRp酶抑制劑篩選的動物模型。
[1]Wedemeyer H,Dore G J,Ward J W.Estimates on HCV disease burden worldwide-filling the gaps[J].J Viral Hepat,2015,22(Suppl 1):1-5.
[2]Hoshida Y,Fuchs B C,Bardeesy N,et al.Pathogenesis and prevention of hepatitis C virus-induced hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol,2014,61(Suppl 1):S79-S90.
[3]Brass V,Moradpour D,Blum H E.Molecular virology of hepatitis C virus(HCV):2006 update[J].Int J Med Sci,2006,3(2):29-34.
[4]Herod M.R,Schregel V,Hinds,C,et al.Genetic complementation of hepatitis C virus nonstructural protein functions associated with replication exhibits requirements that differ from those for virion assembly[J].J Virol,2014,88(5):2748-2762.
[5]Lohmann V,Korner F,Koch J,et al.Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line[J].Science,1999,285(5424):110-113.
[6]Romero-Brey I,Merz A,Chiramel A,et al.Three-dimensional architecture and biogenesis of membrane structures associated with hepatitis C virus replication[J].PLoS Pathog,2012,8(12):e1003056.
[7]Ezat A A,El-Bialy N S,Mostafa H I,et al.Molecular docking investigation of the binding interactions of macrocyclic inhibitors with HCV NS3 protease and its mutants(R155K,D168A and A156V)[J].Protein J,2014,33(1):32-47.
[8]Cheng W.Mechanisms of HCV NS3 helicase monitored by optical tweezers[J].Methods Mol Biol,2015,1259:229-255.
[9]Tanji Y,Hijikata M,Satoh S,et al.Hepatitis C virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions in viral protein processing[J].J Virol,1995,69(3):1575-1581.
[10]Han Q,Manna D,Belton K,et al.Modulation of hepatitis Cvirus genome encapsidation by nonstructural protein 4B[J].J Virol,2013,87(13):7409-7422.
[11]Ross-Thriepland D,Amako Y,Harris M.The C terminus of NS5A domain II is a key determinant of hepatitis C virus genome replication,but is not required for virion assembly and release[J].J Gen Virol,2013,94(Pt 5):1009-1018.
[12]Gouklani H,Bull R A,Beyer C,et al.Hepatitis C virus nonstructural protein 5B is involved in virus morphogenesis[J].J Virol,2012,86(9):5080-5088.
[13]Keating G M,Vaidya A.Sofosbuvir:first global approval[J].Drugs,2014,74(2):273-282.
[14]韓佩君,雷迎峰,呂欣,等.丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3-5B 蛋白的真核表達載體構(gòu)建及其在BHK-21 細胞中的表達[J].科學技術(shù)與工程,2013,13(36):10794-10797.
[15]程萱,陳紅星,楊曉,等.提高制備轉(zhuǎn)基因小鼠效率的研究[J].中國實驗動物學報,2001,9(3):34-37.
[16]Poordad F,Dieterich D.Treating hepatitis C:current standard of care and emerging direct-acting antiviral agents[J].J Viral Hepat,2012,19(7):449-464.
[17]Wang A,Lee D,Moon H,et al.Non-structural 5A protein of hepatitis C virus induces a range of liver pathology in transgenic mice[J].J Pathol,2009,219(2):253-262.