房婷 ，張曉鵬，章晟，戴萌萌，楊秀旭，付玲，于長(zhǎng)明

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.北京軍區(qū)總醫(yī)院 附屬八一兒童醫(yī)院，北京 100700

血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一種耐熱、耐酸及易被胰蛋白酶水解的陽(yáng)離子糖蛋白，主要由成熟的血小板分泌，1974年由Ross 等首先從血小板中獲得[1]。PDGF 作為一種有絲分裂促進(jìn)劑，可以刺激成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分裂和趨化功能、促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和分泌生長(zhǎng)因子，在胚胎發(fā)生、創(chuàng)傷愈合、動(dòng)脈硬化及惡性腫瘤等體內(nèi)多個(gè)病理、生理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，尤其在創(chuàng)傷愈合方面作用更為顯著[2-8]。PDGF 是陽(yáng)離子糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為28×103～35×103，等電點(diǎn)為9.8，由A、B 兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵構(gòu)成同型或異型的二聚體[9]。PDGF 家族有5 個(gè)亞型，即PDGF-A（AA）、PDGF-B（AB 和BB）、PDGF-C（CC）和PDGFD（DD）[10]；5 個(gè)亞型通過(guò)2 種特異性受體（PDGF receptor，PDGFR）α和β調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能[11]。

重組人PDGF-BB（rhPDGF-BB）的相關(guān)研究展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景，受到廣泛關(guān)注[12]。1997年美國(guó)FDA 批準(zhǔn)Regranex 上市，用于慢性糖尿病引發(fā)的神經(jīng)性潰瘍的治療，其活性成分就是釀酒酵母表達(dá)的0.01%的rhPDGF-BB。N 端氨基酸分析表明，從人血小板提取物中分離純化的PDGF-BB 存在3 種不同的剪切形式，即20%的Ser1、45%的Thr6 及35%的Thr33，這些切割的異質(zhì)性導(dǎo)致PDGF 的不均一性[13]。釀酒酵母表達(dá)的109 個(gè)氨基酸的重組PDGF-BB，N 端氨基酸序列同樣存在2 種形式，即109 個(gè)氨基酸的全長(zhǎng)B 鏈和104 個(gè)氨基酸的缺失B鏈Thr6-PDGF-BB，使得PDGF-BB 的精確質(zhì)量控制較困難，而且104個(gè)氨基酸的B 鏈蛋白保持與109個(gè)氨基酸同樣的生物學(xué)活性[14]。

在本研究中，我們采用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了104個(gè)氨基酸的PDGF-BB基因，并進(jìn)行了高密度發(fā)酵培養(yǎng)，利用三步層析對(duì)發(fā)酵上清進(jìn)行純化，并對(duì)蛋白進(jìn)行初步鑒定和生物學(xué)活性測(cè)定，獲得了適于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的、適度糖基化且純度和生物學(xué)活性符合要求的rhPDGF-BB。

1 材料與方法

1.1 材料

人早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60 細(xì)胞為本室保存；BALB/c 小鼠3T3 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；畢赤酵母GS115、大腸桿菌DH5α由本室保存；pMEX9K由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA 連接酶購(gòu)自Promega 公司；TRIzol 總RNA 提取試劑盒為Gibco 公司產(chǎn)品；低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Sigma 公司；YNB 為Difico 公司產(chǎn)品；PDGF-BB 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品IS94/728 購(gòu)自英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所（NIBSC）；PVDF 膜為Millipore 公司產(chǎn)品；PDGF-B（F-3）抗體為Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品；二抗Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody 為Cell Signaling Technology 公司產(chǎn)品；層析介質(zhì)Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（High Sub）、Source 30S、Superdex 75 prep grade 購(gòu) 自GE Healthcare公司。

1.2 目的基因的獲得

采用TRIzol 試劑盒從人早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60 細(xì)胞中提取總RNA。以提取的RNA 為模板進(jìn)行RT-PCR，正向引物為5'-CCGCTCGAG（XhoⅠ）AAAAGAACCATTGCTGAGCCGGCCA-3'，反向引物為5'-GGAATTC（EcoRⅠ）TTAGGTCACAGGCCGT-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

50 μL 反應(yīng)體系：AMV/Tf15×緩沖液10 μL，dNTP 1 mmol/L，MgSO4（50 mmol/L）1 μL，上、下游引物各50 pmol，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶5 U，Tf1DNA 聚合酶5 U，總RNA 50 ng。反應(yīng)條件：48℃逆轉(zhuǎn)錄45 min，94℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶2 min，然后以94℃變性30 s、60℃復(fù)性30 s、72℃延伸40 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃總延伸7 min。回收PCR 產(chǎn)物。

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收獲得的目的基因片段與分泌型酵母表達(dá)載體pMEX9K 片段按照分子摩爾比＞3∶1 的比例構(gòu)建連接體系，用T4DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株，隨機(jī)挑取若干轉(zhuǎn)化后的克隆進(jìn)行菌類(lèi)PCR 鑒定，鑒定為陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 電轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒DNA至酵母感受態(tài)細(xì)胞

將鑒定為陽(yáng)性的pMEX9k-PDGF-B 克隆接種至LB（含氨芐西林）培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日提取重組質(zhì)粒，用SalⅠ-HF 酶線(xiàn)性化，電轉(zhuǎn)化至酵母菌株GS115 中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布MD 平板，篩選得到his+重組克隆，隨機(jī)挑取若干重組克隆進(jìn)行菌類(lèi)PCR 鑒定，鑒定為陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 高表達(dá)菌株的篩選

由于pMEX9K 載體具有G418 抗性，因此取his+重組克隆涂布在不同G418濃度的YPD平板上，用于篩選多拷貝插入子。分別取200 μL 細(xì)胞懸液涂于平板上，G418 終濃度為0.25、0.5、1.0 和2.0 mg/mL，30℃培養(yǎng)2～3 d，篩選具有高G418抗性、且生長(zhǎng)良好的菌株作為表達(dá)菌株。分別挑取單克隆接種于5 mL BMGY 培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，室溫3000 r/min離心5 min，棄上清，用BMMY重懸菌體，30℃、250 r/min 振蕩誘導(dǎo)表達(dá)，每24 h 補(bǔ)加甲醇至0.5%，誘導(dǎo)72 h 后，室溫8000 r/min 離心20 min 收集上清。非還原SDS-PAGE 檢測(cè)各克隆表達(dá)情況，選取目的蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量約30×103條帶）表達(dá)量高的菌株，測(cè)定表達(dá)上清的蛋白濃度（Lowrry法，見(jiàn)2010 年版《中華人民共和國(guó)藥典》（三部）附錄ⅥB 第二法），并對(duì)非還原SDS-PAGE 的結(jié)果掃描進(jìn)行灰度分析。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

用BMGY/BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。挑取新鮮平板上單菌落到裝有25 mL BMGY 培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，28～30℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600nm為2～6（16～18 h）。將25 mL 過(guò)夜培養(yǎng)物接種至含1 L BMGY 培養(yǎng)基的5 L 搖瓶中，28～30℃、250 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（D600nm為2～6）,離心收集菌體。去除原培養(yǎng)基，用1 L BMMY 培養(yǎng)基重懸酵母細(xì)胞，28℃、250 r/min 開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h 添加甲醇至終濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)72 h 后，8000 r/min離心20 min，收集酵母表達(dá)上清。

1.7 重組蛋白的純化

1.7.1 Phenyl HS 疏水層析 表達(dá)上清用1/2 體積的調(diào)節(jié)緩沖液［60 mmol/L PB，3 mol/L（NH4）2SO4，pH7.2］調(diào)節(jié)電導(dǎo)，8000 r/min 離心20 min，上樣于用20 mmol/L PB、1 mol/L（NH4）2SO4（pH7.2）溶液平衡好的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（High Sub）疏水層析柱，上樣結(jié)束后，用20 mmol/L PB、1 mol/L（NH4）2SO4（pH7.2）的溶液再平衡，重組蛋白用洗脫液（20 mmol/L PB，50%乙二醇，pH7.2）洗脫，收集目的蛋白峰。

1.7.2 Source 30S 離子層析 用平衡緩沖液（20 mmol/L PB，pH7.2）稀釋Phenyl HS 洗脫峰至電導(dǎo)值為6 ms/cm 以下，直接上樣于用平衡緩沖液平衡好的Source 30S離子層析柱，用20 mmol/L PB、1 mol/L NaCl（pH7.2）梯度洗脫，收集目的蛋白。

1.7.3 Superdex 75 凝膠層析 目的蛋白峰用0.45 μm 孔徑的濾膜過(guò)濾后，用Superloop 分次上樣，每次上樣體積不超過(guò)柱體積的3%。采用Hiload Superdex 75 pg 凝膠濾裝柱，平衡液為20 mmol/L PB、0.15 mol/L NaCl（pH7.2），一步法收集洗脫峰。

1.8 重組蛋白的鑒定和活性測(cè)定

將純化的rhPDGF-BB 進(jìn)行還原及非還原SDSPAGE，分離膠濃度為15%，上樣量分別為10 和2 μg。Western 印跡條件：15% SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)條件為300 mA 穩(wěn)流1 h，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，抗PDGF-B 的一抗按1∶1000 稀釋?zhuān)拱?∶10000 用封閉液稀釋。采用Edman 化學(xué)降解法測(cè)定N 端前5個(gè)氨基酸序列。

采用BALB/c 小鼠3T3 細(xì)胞株/MTT 法測(cè)定純化后的rhPDGF-BB 生物活性。具體方法如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BALB/C 3T3 細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以測(cè)定培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)18～24 h。取PDGF-BB 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，以無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液溶解并稀釋至40 U/mL，同法稀釋待測(cè)樣品，將已預(yù)稀釋的參考品和待測(cè)樣品于96 孔板上用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行倍比梯度稀釋?zhuān)沧?2 梯度濃度，每一梯度設(shè)2 個(gè)復(fù)孔；將梯度稀釋好的參考品和待測(cè)樣品每孔加入100 μL至已接種BALB/c 3T3細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)64～72 h。加入MTT 溶液，培養(yǎng)5 h 后加入DMSO 裂解液，室溫放置30 min 后比色，測(cè)定D510nm值，計(jì)算rhPDGF-BB的生物活性。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用四參數(shù)回歸計(jì)算法進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得和酵母表達(dá)株的構(gòu)建

RT-PCR 一步法獲得目的基因312 bp，命名為PGBF-BB，經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶大小正確（圖1），與本室保存的pMEX9K 載體[14]連接構(gòu)建pMEX9K-PGBF-B 表達(dá)連接載體。pMEX9K由畢赤酵母蛋白表達(dá)專(zhuān)用載體pPIC9K 改構(gòu)而來(lái)，通過(guò)AXO1（alochol oxidase，乙醇氧化酶）啟動(dòng)子調(diào)控外源蛋白的表達(dá)，并且有由α交配因子（α-factor）分泌的信號(hào)序列引導(dǎo)外源蛋白分泌表達(dá)。鑒定為陽(yáng)性的表達(dá)載體經(jīng)SalⅠ酶線(xiàn)性化后電轉(zhuǎn)化受體菌GS115，得到his+重組克隆。PCR 法鑒定重組克隆，檢測(cè)引物為5'AXO1引物和3'AXO1引物，結(jié)果（圖2）為2 條帶，一條為約2.2 kb 的野生型AXO1基因，另一條為789 bp 的含目的基因的片段，其中目的基因312 bp，AXO1基因側(cè)翼序列長(zhǎng)480 bp。

2.2 高表達(dá)株的篩選

pMEX9K載體賦予重組克隆對(duì)G418的抗性，而這種抗性的水平與整合入酵母基因組中載體的拷貝數(shù)呈正相關(guān)[15]。經(jīng)過(guò)4 輪篩選，最終在含有2.0 mg/mL G418 的YPD 平板上篩選到6 個(gè)克隆，將重組克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，15% SDS-PAGE 顯示（圖3）發(fā)酵上清中主要為目的蛋白條帶，可見(jiàn)重組蛋白為分泌表達(dá)；2.0 mg/mL G418 平板的重組克隆經(jīng)誘導(dǎo)后重組蛋白的表達(dá)量最高，振蕩培養(yǎng)后加甘油凍存作為發(fā)酵用種子。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖1 RT-PCR擴(kuò)增PDGF-BB基因

圖2 菌落PCR結(jié)果

畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，可利用甲醇作為其惟一碳源。在代謝甲醇的過(guò)程中，由于相關(guān)酶的結(jié)合效率低，使得畢赤酵母代償性地產(chǎn)生大量的酶，而調(diào)控該酶的啟動(dòng)子也正是驅(qū)動(dòng)外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子。因此，通過(guò)BMGY 培養(yǎng)基增菌過(guò)程及更換BMMY 培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，SDS-PAGE 分析目的蛋白在發(fā)酵上清中的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加表達(dá)量逐漸升高，48 和72 h 差異不明顯，72 h 時(shí)表達(dá)量最高，且很據(jù)蛋白濃度測(cè)定和BandScan 灰度掃描結(jié)果計(jì)算，目的蛋白的表達(dá)量高于100 μg/mL。

2.4 PDGF-BB的純化

發(fā)酵上清調(diào)節(jié)電導(dǎo)后先經(jīng)Phenyl HS 捕獲，通過(guò)一步洗脫將目的蛋白有效富集，同時(shí)去除了大部分發(fā)酵培養(yǎng)基中的色素和其他雜蛋白（圖5）；第二步為Source 30S，此步基于目的蛋白與雜蛋白離子性質(zhì)的不同，同時(shí)由于該填料粒徑較小、分布均勻具有很高的分辨率，通過(guò)進(jìn)一步的梯度洗脫可將絕大部分雜蛋白和剩余色素去除，同時(shí)將目的蛋白進(jìn)一步富集濃縮（圖6）；最后通過(guò)Superdex 75 凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行精細(xì)純化，去除痕量雜質(zhì)并完成緩沖液置換（圖7）。

2.5 PDGF-BB的鑒定和活性測(cè)定

圖3 高拷貝篩選后蛋白表達(dá)水平結(jié)果

圖4 PDGF-BB不同誘導(dǎo)時(shí)間的SDS-PAGD圖

非還原及還原SDS-PAGE 結(jié)果（圖8A）掃描后經(jīng)BandScan 5.0 軟件分析顯示，獲得的目的蛋白為同源二聚體形式，純度大于95%，單體形式表觀相對(duì)分子質(zhì)量約為14.5×103。Western 印跡結(jié)果（圖8B）表明目的蛋白能特異地與一抗結(jié)合，而陰性對(duì)照菌株和未經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)菌株的發(fā)酵上清均無(wú)陽(yáng)性條帶。N 端測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖9，前5 個(gè)氨基酸殘基為T(mén)-I-AE-P，與理論一致，說(shuō)明該重組蛋白N 端加工正確，未發(fā)生不正確剪切。Lowrry 法測(cè)定的PDGF-BB 濃度為3.21 mg/mL，采用BALB/c 3T3 細(xì)胞株/MTT 法測(cè)定的純化后目的蛋白的活性為1.61×106IU/mL，比活為5.0×105IU/mg（圖10）。

圖5 Phenyl HS層析結(jié)果圖

圖6 Source 30S層析結(jié)果圖

3 討論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是20 世紀(jì)80～90 年代發(fā)展起來(lái)的極具潛力的酵母表達(dá)系統(tǒng)[17]，利用該系統(tǒng)已成功表達(dá)了幾百種酶、藥用和疫苗用蛋白[18]。該系統(tǒng)具有許多其他蛋白表達(dá)系統(tǒng)所不具備的優(yōu)點(diǎn)，如可進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、廉價(jià)、適于工業(yè)化生產(chǎn)，外源基因不易丟失，表達(dá)量高，許多蛋白甚至可達(dá)每升克級(jí)以上[19]，作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后正確加工和修飾，即二硫鍵的形成、蛋白的磷酸化、折疊、信號(hào)序列的加工和糖基化，而且不會(huì)像釀酒酵母產(chǎn)生超糖基化[20]。PDGF 已在多種系統(tǒng)中成功表達(dá)，如大腸桿菌[21]、釀酒酵母[14]、CHO 真核細(xì)胞[22]等，但具有如大腸桿菌表達(dá)為包含體、需要復(fù)性；釀酒酵母表達(dá)量低、難以量產(chǎn)；CHO系統(tǒng)成本高昂、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

圖7 Superdex 75層析結(jié)果圖

圖8 PDGF-BB蛋白SDS-PAGE（A）和Western印跡（B）分析

我們用畢赤酵母系統(tǒng)以分泌形式表達(dá)rhPDGFBB，表達(dá)量可達(dá)每升百克級(jí)別，而且目的蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中，不需復(fù)雜的破菌過(guò)程，且上清中雜蛋白含量很低，便于分離純化。通過(guò)三步實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的高效純化，獲得了N 端整齊均一、純度和活性都符合要求的rhPDGF-BB 蛋白。綜上，我們利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組人PDGF-BB，表達(dá)產(chǎn)量高，成本低，工藝簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化放大，有良好的市場(chǎng)前景。

圖9 PDGF-BB蛋白N端測(cè)序結(jié)果

圖10 PDGF-BB蛋白的MTT法活性測(cè)定結(jié)果

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