周璐 黃瑩雪 胡彬 吳侃 邵雪寶 李阿梅 陳浩 孫建方

皮膚惡性肢端黑素瘤中c-kit基因的表達(dá)及突變分析

周璐 黃瑩雪 胡彬 吳侃 邵雪寶 李阿梅 陳浩 孫建方

目的 分析皮膚惡性肢端黑素瘤患者中c-kit基因突變的頻率與類型及表達(dá)情況。方法 應(yīng)用PCR、基因測序、免疫組化染色等方法檢測115例皮膚惡性黑素瘤（CMM）患者、30例肢端黑素細(xì)胞痣患者及15例健康人皮膚組織標(biāo)本中c-kit基因序列及c-kit蛋白表達(dá)情況。采用χ2檢驗、Mann-WhitneyU檢驗、Spearman相關(guān)檢驗等統(tǒng)計學(xué)方法分析數(shù)據(jù)。結(jié)果 93例肢端CMM中84例（90.3%）表達(dá)c-kit蛋白，22例非肢端CMM中18例（81.8%）表達(dá)。58例肢端侵襲性CMM中，29例真表皮交界處腫瘤細(xì)胞c-kit蛋白表達(dá)強陽性，而8例真皮內(nèi)呈侵襲浸潤性生長的腫瘤細(xì)胞則不表達(dá)或弱表達(dá)c-kit蛋白；健康人皮膚組織中c-kit蛋白表達(dá)較弱；在30例肢端黑素細(xì)胞痣中19例（63.3%）陽性表達(dá)。c-kit蛋白在93例肢端CMM組的陽性表達(dá)率（90.3%）顯著高于肢端黑素細(xì)胞痣組（63.3%），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.14，P＜0.05）；71例侵襲性CMM中，c-kit蛋白在58例肢端CMM中陽性表達(dá)55例（94.8%），在13例非肢端CMM中陽性表達(dá)11例，在肢端CMM的表達(dá)高于非肢端CMM，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.18，P＜0.05）。在原位、侵襲性、轉(zhuǎn)移性肢端CMM組織中，c-kit蛋白表達(dá)水平與腫瘤的臨床病理特征均未見明顯相關(guān)（均P＞0.05）。115例CMM中檢測到4例患者存在c-kit基因點突變，其中3例為L576P突變，1例為K642E突變，且均為肢端CMM，免疫組化顯示彌漫性c-kit蛋白強陽性表達(dá)。結(jié)論 在侵襲性CMM中，c-kit蛋白在肢端CMM中的表達(dá)高于非肢端CMM。肢端CMM中檢測到c-kit基因點突變，均為肢端型較常見的突變類型，但突變率較國外文獻低。

黑色素瘤；痣，色素；原癌基因蛋白質(zhì)c-kit；點突變；C-kit基因

皮膚惡性黑素瘤（CMM）依據(jù)是否有紫外線暴露史及解剖部位分為無慢性光損傷型、有慢性光損傷型、黏膜型及肢端CMM［1］。肢端CMM主要是指腫瘤生長于無毛的皮膚表面，如手掌、足底、甲床等部位。c-kit基因的活化突變與多種人類惡性腫瘤相關(guān)，如胃腸間質(zhì)瘤、精原細(xì)胞瘤等［2］。和其他類型的CMM相比，肢端和黏膜CMM存在不同的遺傳變異和生物學(xué)行為，研究發(fā)現(xiàn)，36%的肢端CMM存在c-kit基因突變和（或）基因拷貝數(shù)增加，而BRAF和NRAS基因的突變較少見［1，3］。本研究分析中國人群肢端CMM患者c-kit基因突變的頻率與類型及蛋白表達(dá)情況，為肢端CMM的靶向治療提供新的依據(jù)。

一、資料與方法

（一）病例資料：選取2010年1月至2013年6月我院經(jīng)組織病理學(xué)診斷的115例CMM石蠟包埋標(biāo)本，15例健康人皮膚石蠟標(biāo)本，30例良性黑素細(xì)胞痣石蠟標(biāo)本。115例CMM中，男49例，女66例，年齡24～90歲，中位年齡60歲。所有患者均經(jīng)2位有經(jīng)驗的皮膚病理科醫(yī)生通過臨床表現(xiàn)、組織學(xué)及免疫組化染色結(jié)果（包括 S100、HMB-45、MART-1、ki67）綜合分析，確診為CMM。115例中，腫瘤分布于肢端93例，非肢端22例；組織學(xué)上表現(xiàn)為原位腫瘤的32例，侵襲性腫瘤的83例（其中轉(zhuǎn)移性腫瘤12例）。93例惡性肢端CMM患者中，女56例，男37例；Clark分級Ⅰ～Ⅱ級38例，Ⅲ～Ⅴ級55例。22例惡性非肢端CMM中，女10例，男12例；ClarkⅠ～Ⅱ級7例，Ⅲ～Ⅴ級15例。肢端黑素細(xì)胞痣30例中，發(fā)育不良痣4例，普通良性痣26例。

（二）c-kit基因突變檢測：

1.石蠟包埋組織中基因組DNA提?。汉心[瘤的蠟塊組織以5μm厚度切片，采用QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒（德國Qiagen公司），按說明操作，最終獲得DNA樣本，并通過紫外分光光度計測定DNA濃度。

2.c-kit基因第11、13、17號外顯子 PCR 擴增：kit基因引物序列、擴增片段長度和退火溫度見表1［4］。各對PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。25μl擴增體系為：1～5μmol基因組DNA（DNA質(zhì)量濃度100～200 ng/25μl）加入 12.5μl PromegaGoTaq? Green Master Mix中，分別加入kit基因第11、13、17號外顯子對應(yīng)的上下游引物各3μl，最后加入去離子水配成25μl的總反應(yīng)體系，PCR儀（美國ABI公司）上進行目的基因片段擴增，擴增條件：95℃預(yù)變性5min后，94℃變性25 s，各自退火溫度退火30 s，72℃延伸25 s，完成45個循環(huán)。72℃總延伸5min，放置于4℃保存。

3.DNA測序：以上PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳擴增出特異性目的條帶后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序。

（三）免疫組化染色：所有石蠟組織標(biāo)本按3μm厚度切片，敷貼于10%多聚賴氨酸預(yù)先處理的載玻片上，石蠟切片脫蠟脫水，置于EDTA緩沖液（0.01 mol/L，pH8.0）中高壓修復(fù)10min，室溫自然冷卻；滴加一抗（即用型兔抗人CD117抗體），濕盒中4℃過夜；再滴加二抗（HRP-抗鼠/兔抗體）孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，1%鹽酸乙醇分化，中性樹膠封片。一抗、二抗、DAB顯色液均為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。上述各步驟之間均以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次。以已證實的肥大細(xì)胞瘤組織切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為空白對照。所有組織染色條件相同。采用日本Nikon公司顯微鏡工作臺及照相系統(tǒng)觀察結(jié)果。

（四）免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜和（或）胞質(zhì)呈棕褐色顆粒著色為陽性細(xì)胞，不著色者為陰性；皮脂腺、汗腺基底層及肥大細(xì)胞陽性染色為陽性內(nèi)對照。高倍鏡下（400×）隨機選擇5個視野，計數(shù)全部有核細(xì)胞，分別計算切片中著色強度和計算著色陽性細(xì)胞百分率。著色強度：強著色為3分，中等著色為2分，弱著色為1分，不著色或著色不清為0分；著色陽性細(xì)胞百分率 ＞50%為3分，10%～50%為2分，＜10%為1分，不著色為0分，最后將兩項分值相乘得出最終的免疫組化積分。組化積分：0～1分為（-），2～3分為（+），4～6分為（++），＞6分為（+++）。結(jié)果判定由2名皮膚病理醫(yī)生獨立進行，每張組化切片均與HE染色切片進行對照觀察，以正確判斷腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)的范圍。

（五）統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，等級資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗，c-kit和腫瘤進展、腫瘤分級間相關(guān)性研究通過Spearman相關(guān)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 c-kit基因第11、13、17號外顯子擴增引物序列及退火溫度［4］

二、結(jié)果

（一）c-kit蛋白在CMM中的免疫組化表達(dá)：15例健康人皮膚組織中c-kit蛋白表達(dá)較弱，2例弱陽性表達(dá)散在分布于個別表皮基底層的黑素細(xì)胞，染色程度弱（圖1）。30例肢端黑素細(xì)胞痣組織中，c-kit蛋白陽性表達(dá)19例，其中陽性表達(dá)+++3例，++9例，+7例，陽性染色位于細(xì)胞膜和（或）胞質(zhì)（圖2）。93例肢端CMM中84例（圖3）、22例非肢端CMM中18例表達(dá)c-kit蛋白（圖4）。轉(zhuǎn)移性CMM中，真皮內(nèi)腫瘤細(xì)胞c-kit蛋白表達(dá)弱陽性或陰性。58例肢端侵襲性CMM中，29例真表皮交界處腫瘤細(xì)胞c-kit蛋白表達(dá)強陽性，而8例真皮內(nèi)呈侵襲浸潤性生長的腫瘤細(xì)胞則不表達(dá)或弱表達(dá)c-kit蛋白。

肢端CMM組93例中c-kit蛋白陽性表達(dá)84例（90.3%），顯著高于肢端黑素細(xì)胞痣組（63.3%），兩組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.14，P＜0.05）。肢端CMM 58例中c-kit蛋白陽性表達(dá)55例（94.8%），13例非肢端CMM中陽性表達(dá)11例，在肢端CMM的表達(dá)高于非肢端CMM，兩組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.18，P＜0.05）。肢端CMM在男性與女性、Clark分級Ⅰ～Ⅱ級與Ⅲ～Ⅴ級、有與無潰瘍、有與無炎癥細(xì)胞浸潤組間，經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗，c-kit蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，表2）。在肢端CMM中，采用Spearman相關(guān)檢驗，c-kit蛋白表達(dá)與腫瘤進展、Clark等級、Breslow厚度分級均無相關(guān)性（均P＞0.05）（表3）。

（二）皮膚CMM中c-kit突變基因的檢測結(jié)果：對115例皮膚CMM石蠟包埋組織進行基因組DNA提取，以基因組DNA為模板，分別采用針對c-kit基因第11、13、17號外顯子的3對引物在各自的條件下分別擴增產(chǎn)物（圖5）后，進行產(chǎn)物序列測定并與Genbank公布的序列進行比對。

通過對c-kit基因11、13、17號外顯子擴增的特異性DNA序列測序發(fā)現(xiàn)，115例CMM組織標(biāo)本中共檢測到4例突變，且均為點突變，c-kit基因總突變率為3.5%。11、13號外顯子分別檢測到有3例和1例突變，17號外顯子未檢測到突變；11號外顯子點突變類型均為L576P（即11號外顯子第1727位胸腺嘧啶T→胞嘧啶C的突變，使得密碼子CTT變?yōu)镃CT，導(dǎo)致576位的氨基酸亮氨酸L→脯氨酸P）；13號外顯子點突變類型為K642E（即13號外顯子第1384位腺嘌呤A→鳥嘌呤G的突變，使得密碼子AAA變?yōu)镚AA，導(dǎo)致462位的氨基酸賴氨酸K→谷氨酸E）（圖6），且出現(xiàn)突變的組織均再重復(fù)2次進行PCR及測序。同時，再次選取上述4例含有突變的腫瘤旁正常組織，提取DNA、擴增并測序（方法同前），均未發(fā)現(xiàn)基因突變，提示L576P、K642E是腫瘤組織中發(fā)生的基因突變。在4例c-kit突變病例的組化切片中，均表現(xiàn)為彌漫性CD117蛋白的強陽性表達(dá)。

圖1 健康人肢端皮膚組織c-kit蛋白弱陽性表達(dá)（DAB染色×100）

圖2 肢端黑素細(xì)胞痣組織c-kit蛋白陽性表達(dá)（DAB染色×100）

圖3 肢端原位皮膚惡性黑素瘤組織c-kit蛋白陽性表達(dá)（DAB染色×40）

圖4 非肢端皮膚惡性黑素瘤組織c-kit蛋白強陽性表達(dá)（DAB染色×100）

表2 93例肢端皮膚惡性黑素瘤組織中c-kit蛋白（CD117）表達(dá)與腫瘤的臨床及病理特征的聯(lián)系

表3 肢端皮膚惡性黑素瘤組織中c-kit蛋白（CD117）表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析

圖5 c-kit 11、13、17號外顯子凝膠電泳圖 1～3：陰性對照；M：標(biāo)準(zhǔn)參照物（自上向下：600、500、400、300、200、100 bp）；4～ 6 和7～9：分別為患者1和患者2的11、13和17號外顯子（分別為290、280、330 bp）

三、討論

c-kit蛋白（CD117）是跨膜的酪氨酸激酶受體，與配體干細(xì)胞因子結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用；在多種正常細(xì)胞中均檢測到c-kit蛋白表達(dá)增高，如造血細(xì)胞、精細(xì)胞、Cajal間質(zhì)細(xì)胞、乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及黑素細(xì)胞等［5］。在 CMM 中，c-kit突變常見于黏膜型、肢端型及原發(fā)于慢性光損傷皮膚的CMM；多個研究報道，在肢端CMM中 c-kit突變率為11%～25%［1，5-6］。c-kit蛋白在良性黑素細(xì)胞痣及黑素細(xì)胞中均可表達(dá)，提示在黑素細(xì)胞生長、增殖的過程中c-kit蛋白可能發(fā)揮著重要作用［5，7］。

在一項包括了522例中國人CMM的調(diào)查中顯示，肢端CMM為中國人群中最常診斷的CMM亞型，約占41.8%［8］。李麗等［9］檢測 262 例中國人 CMM 中 21 例患者腫瘤組織中c-kit基因存在明顯擴增，其中肢端型和非肢端型擴增比例分別為8.24%（7/85）和5.06%（4/79）；上述21例患者中僅2例同時伴有c-kit基因突變，突變類型為11號外顯子L576P和13號外顯子K642E突變。我們檢測了115例中國人CMM組織c-kit蛋白表達(dá)及基因突變情況，其中肢端型占80.9%。文獻報道，c-kit在肢端CMM中的陽性表達(dá)比例范圍較廣（37.3%～81%）［6，10］；我們通過免疫組化染色顯示，90.3%肢端CMM和81.8%非肢端CMM表達(dá)c-kit蛋白，數(shù)值略高于文獻報道。我們還觀察到，在侵襲性CMM中，真表皮交界處腫瘤細(xì)胞c-kit蛋白表達(dá)強陽性，而真皮內(nèi)呈侵襲浸潤性生長的腫瘤細(xì)胞則不表達(dá)或弱表達(dá)c-kit蛋白，此現(xiàn)象與既往文獻報道類似［7］，提示在大部分CMM進展過程中可出現(xiàn)c-kit蛋白失表達(dá)的現(xiàn)象。另一方面，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，c-kit蛋白在皮膚CMM中的表達(dá)與其臨床病理特征間均未見明顯差異及相關(guān)性。

圖6 原發(fā)性皮膚黑素瘤中c-kit基因突變情況 6A：c-kit 11號外顯子序列；6B：c-kit 11號外顯子L576P突變；6C：c-kit 13號外顯子序列；6D：c-kit 13號外顯子K642E突變。箭頭所指即為突變位點

我們研究中發(fā)現(xiàn)4例CMM組織存在c-kit基因的點突變，總突變率為3.48%，較既往文獻報道的比例偏低［6，9-10］；我們的病例以肢端CMM為主，在肢端CMM中突變率為4.30%，提示肢端CMM的突變率可能較其他部位高，且突變位點位于11號外顯子（L576P）和13號外顯子（K642E）。文獻報道，90%存在c-kit基因突變的CMM常表現(xiàn)為點突變［11］。CMM最常見的c-kit突變位點位于11號染色體的L576P點突變（約占總突變30%～40%），其次為位于13號染色體的 K642E 點突變（約占總突變 16.3%）［4，6］。本研究發(fā)現(xiàn)的兩種點突變類型與國內(nèi)文獻報道相似［9］，未發(fā)現(xiàn)新的突變位點或突變形式。文獻報道，在不典型肢端黑素細(xì)胞痣中，發(fā)現(xiàn)c-kit蛋白表達(dá)與突變之間缺乏相關(guān)性［4］；同樣，本研究CMM組織中未發(fā)現(xiàn)c-kit表達(dá)與c-kit基因突變之間的聯(lián)系。因此，在肢端CMM患者中，c-kit免疫組化染色并不能做為篩選c-kit基因突變的有效方法。值得注意的是，4例檢測出突變的肢端CMM病例，其c-kit蛋白表達(dá)均為強陽性，占肢端CMM總強陽性病例的9.52%，提示c-kit免疫組化顯示強陽性的病例接受酪氨酸激酶抑制劑治療也可能獲得較好療效。

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2014-05-08）

（本文編輯：顏艷）

Expression and mutation analysis of the c-kit gene in acral cutaneous malignant melanoma

Zhou Lu,Huang Yingxue,Hu Bin,Wu Kan,Shao Xuebao,Li A′mei,Chen Hao,Sun Jianfang.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s:Chen Hao,Email:ch76ch@163.com;Sun Jianfang,Email:sunjf57@163.com

ObjectiveTo analyze the frequency and type of mutations in the c-kit gene,and to measure the expression of c-kit protein in patients with acral malignant melanoma.MethodsSkin tissue specimens were collected from the lesions of 115 patients with cutaneous malignant melanoma（CMM）and 30 patients with acral melanocytic nevi,as well as normal skin of 15 healthy human controls.PCR and DNA sequencing were performed to analyze the sequence of the c-kit gene,and immunohistochemical staining was conducted to observe c-kit protein expression in tissue samples.Statistical analysis was done by Chi-square test,Mann-Whitney U test and Spearman′s rank correlation test.ResultsC-kit protein was expressed in 90.3% （84/93）of acral CMM specimens,81.8% （18/22）of non-acral CMM specimens,and 63.3% （19/30）of acral melanocytic nevus specimens.Among 58 acral invasive CMM specimens,29 showed strong expression of c-kit protein in tumor cells at the dermal-epidermal junction,8 showed negative or weak ckit expression in invasive and infiltrating tumor cells in the dermis.The expression rate of c-kit protein was significantly higher in acral CMM specimens than in acral melanocytic nevus specimens （χ2=12.14,P＜0.05）,and higher in acral than in non-acral invasive CMM specimens（94.8% （55/58）vs.11/13,χ2=4.18,P＜0.05）.No significant correlation was observed between the clinicopathological feature of melanoma and expression of c-kit protein inin situ,invasive or metastatic acral CMM tissues（allP＞0.05）.C-kit gene mutations were detected in 4 out of the 115 CMM cases,including L576P mutation in 3 cases and K642E mutation in 1 case.All the 4 patients carrying mutations were diagnosed as acral CMM,and exhibited diffuse and strong expression of c-kit protein.ConclusionsThe expression of c-kit protein is stronger in acral than in non-acral invasive CMM lesions.All the mutations detected in these cases are common types of c-kit mutations in acral CMM,but the mutation frequency is lower than that reported in foreign literature.

Melanoma;Nevus,pigmented;Proto-oncogene proteins c-kit;Point mutation;C-kit gene

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.012

國家自然科學(xué)基金（81102067）

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所

陳浩，Email：ch76ch@163.com；孫建方，Email：sunjf57@163.com