余蕾 張蕾 顧峻嫣 程明亮 黃林 夏曙華 程樹強 簡單 王荔平 孫朝琴 王焱 楊國珍

·技術(shù)與方法·

外顯子組測序技術(shù)對疑似魚鱗病患兒進行分子診斷的方法學(xué)研究

余蕾 張蕾 顧峻嫣 程明亮 黃林 夏曙華 程樹強 簡單 王荔平 孫朝琴 王焱 楊國珍

外顯子組測序是利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法，由于其具有對常見和罕見變異的高靈敏度，能發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)絕大部分疾病相關(guān)變異以及僅需對約1%的基因組進行測序等優(yōu)點，使外顯子組測序成為鑒定孟德爾遺傳病致病基因最有效的策略，也被運用于復(fù)雜易感基因的研究和臨床診斷中［1］。本研究針對1例臨床上疑似魚鱗病的患兒，通過外顯子組測序?qū)嶒?，檢測該患兒在遺傳水平上攜帶的突變，為臨床診斷和治療提供相關(guān)信息，并探討利用外顯子組測序作為臨床疑難雜癥輔助治療手段的可能性。

一、對象

患兒男，出生于2013年8月1日（剖宮產(chǎn)出生，其母產(chǎn)前5 d入院檢查持續(xù)尿蛋白+++，血清白蛋白較低，輸血漿不能糾正），體重2.4 kg，發(fā)育基本正常，全身皮膚硬，無彈性，火紅焦化狀脫皮；頭發(fā)呈卷曲碾碎感。顯微鏡下見頭發(fā)呈竹節(jié)狀，臨床診斷為火棉膠嬰兒（圖1）。除此癥狀之外，無其他異常，從外觀上看懷疑為魚鱗病。染色體和染色體微缺失檢查正常。父母體健，否認近親結(jié)婚，家族中未見類似患兒。

圖1 疑似魚鱗病患兒全身皮膚硬，無彈性，火紅焦化狀脫皮；頭發(fā)呈卷曲碾碎感

二、方法

1.試劑與儀器：QIAamp DNA Blood Mini Kit（德國Qiagen公司；貨號：51104），Gnomegen DNA-Seq Library Preparation Kit（美國Gnomegen公司；貨號：K02422），Gnome size selector（美國 Gnomegen公司；貨號：R02424L），PCR 儀（美國 ABI公司；型號：2720），Concentrator plus真空離心濃縮儀（德國eppendorf公司），小型高速離心機（德國eppendorf公司，型號：5418），實時定量PCR儀（德國eppendorf公司，型號：4376600），通用電泳儀（杭州匯爾儀器，型號：JY300C），渦旋儀（北京京輝凱業(yè)科技有限公司；型號：JHX24H），金屬?。ê贾萑鹫\儀器有限公司；型號：DH100-1）。

2.血液提取及基因組DNA的純化、定量：取患兒EDTA抗凝全血2～3ml，提取DNA，DNA的純化采用QIAamp DNA Blood Mini Kit，按試劑盒說明書操作。電泳檢測基因組DNA的完整性。

3.外顯子捕獲：液相雜交法進行目標(biāo)基因篩選：

（1）文庫制備：文庫構(gòu)建采用Gnomegen DNA-Seq Library Preparation Kit，首先利用Covaris專利的自適應(yīng)聚焦聲波（Adaptive Focused Acoustics，AFA）技術(shù)將樣品基因組DNA進行隨機打斷，獲得片段化DNA，斷裂要求：300～500 bp片段，以400 bp為中心峰值；然后對片段化的DNA進行末端修復(fù)和加dA尾，經(jīng)過磁珠純化之后，在純化的DNA樣品中加入連接接頭，再次進行磁珠純化，然后對帶接頭的純化DNA樣品進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行磁珠純化后，制成300～500 bp片段文庫，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）液相雜交、捕獲與洗脫：人工合成探針（圖2B），首先將擴增的DNA文庫樣品與制備好的探針Nimblegen SeqCap EZ Human Exome Library v3.0（帶生物素）加入適當(dāng)?shù)囊合嚯s交體系中，經(jīng)過47℃，72 h溫浴，雜交完成。然后用鏈霉親和素磁珠對雜交產(chǎn)物進行序列捕獲，將目標(biāo)DNA（帶生物素）綁定到磁珠上。之后用3種洗脫緩沖液對磁珠進行洗脫，洗脫后的目標(biāo)DNA溶液-20℃保存。

（3）篩選后文庫的擴增及純化：以洗脫后的目標(biāo)DNA溶液為模板進行連接介導(dǎo)的PCR（Ligation.Mediated PCR，簡稱LM-PCR）擴增，對捕獲的目標(biāo)基因進行富集。PCR產(chǎn)物經(jīng)過Gnome size selector磁珠純化后，-20℃保存。

（4）qPCR法鑒定捕獲效率：經(jīng)過捕獲的DNA，一般絕對數(shù)量較低，需要經(jīng)過另一輪擴增才能產(chǎn)生用于高通量測序的樣品。將捕獲前后的DNA文庫通過內(nèi)部參照序列的qPCR分析，可以判斷捕獲的效率及專一性。以PCR水為空白對照模板，擴增的DNA文庫為陽性對照模板，以擴增后的捕獲DNA為實驗組模板，選用4對引物進行qPCR SYBR Green實驗，通過比較捕獲組（CAP）和未捕獲組（NON）的Ct值來鑒定捕獲效率。

4.高通量測序：將捕獲富集并驗證的DNA文庫采用Illumina HiSeq 2000平臺測序，讀長為2×100 bp雙向測序，測序深度為＞100×。

5.生物信息學(xué)分析：對于測序原始數(shù)據(jù)，首先采用fastqc軟件對數(shù)據(jù)質(zhì)量做質(zhì)控，然后采用bwa軟件與參考基因組hg19作比對，將比對結(jié)果去除重復(fù)片段并排序，接著采用GATK Indelrealigner對結(jié)果做重比對，然后采用GATK UnifiedGenotyper做變異檢測，得到snp和indel的信息，并過濾snp和indel得到可信的snp和indel?？尚诺膕np和indel被用來做后續(xù)的annovar、sift和polyphen注釋，最后搜索OMIM數(shù)據(jù)庫，查看樣本疾病攜帶信息，并采用在線版HGMD 數(shù)據(jù)庫做了注釋［2-6］。

6.PCR擴增和sanger測序：再次以該患兒的基因組DNA為模板，針對檢測到的突變位點，采用PCR擴增的方法，對位點附近序列進行擴增，引物序列為正向引物：5′-AGCTCAATGTAGCCTTCATGA-3′，反向引物：5′-TGGCTAAC TCCCACATAATGAA-3′。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5min，94 ℃ 30 s，58℃1min，72℃30 s，30個循環(huán)，再72℃7min。對擴增所得PCR產(chǎn)物回收、純化之后，進行sanger測序。

圖2 液相雜交兩種探針的設(shè)計圖 2A：普通探針設(shè)計使得目標(biāo)序列每個位點的覆蓋度為1～2×，且探針密度不夠高，導(dǎo)致有些區(qū)域的突變無法捕獲；2B：本研究設(shè)計的探針使得目標(biāo)區(qū)域的每個位點都被多重覆蓋，且探針密度非常高，不同位置的突變都可以被捕獲

三、結(jié)果

對不明病因患兒的外顯子組測序的流程包括樣品收集及DNA提取，文庫制備和目標(biāo)基因篩選，測序及數(shù)據(jù)分析3個模塊。

1.基因組DNA純化：針對血液樣本進行基因組DNA純化，電泳檢測結(jié)果顯示，DNA的完整性良好。Qubit定量結(jié)果顯示，該基因組DNA的質(zhì)量濃度為130 mg/L，符合文庫構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)。

2.文庫構(gòu)建和目標(biāo)基因篩選：對純化好的基因組DNA進行文庫構(gòu)建和目標(biāo)基因篩選，對目標(biāo)基因篩選后文庫進行qRT-PCR質(zhì)檢，通常認為捕獲前后參照序列的富集倍數(shù)（2△Ct）超過30倍，即△Ct大于5時，便可以進入下一步高通量測序。結(jié)果（表1）顯示，血液樣品4對引物的△Ct值均大于7，表示目標(biāo)序列均富集了135倍以上。

3.高通量測序及數(shù)據(jù)分析：對捕獲后的文庫進行上機測序和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，該DNA樣品捕獲的目標(biāo)區(qū)域大小為64 Mbp，符合人基因組外顯子區(qū)的大小。目標(biāo)區(qū)域的測序深度（即測序得到的堿基總量與目標(biāo)區(qū)域大小的比值）為106×，通常認為當(dāng)測序深度在10～15×以上時，目標(biāo)區(qū)域覆蓋度和測序錯誤率控制均得以保證。序列匹配時，發(fā)現(xiàn)有超過99.3%的高質(zhì)量讀長被匹配到人類基因組參考序列（hg19）上，總共有超過98.6%的外顯子區(qū)域序列被覆蓋了4倍以上，超過97.4%的外顯子區(qū)域序列被覆蓋了10倍以上，超過95.0%的外顯子區(qū)域序列被覆蓋了20倍以上，超過90.5%的外顯子區(qū)域序列被覆蓋了30倍以上，超過83.8%的外顯子區(qū)域序列被覆蓋了40倍以上，超過75.9%的外顯子區(qū)域序列被覆蓋了50倍以上。

對該患兒的外顯子組測序共發(fā)現(xiàn)了172 639個SNP位點，20 434個插入/缺失位點，其中新的SNP位點為18 825個，新的Indels為6 890個。通過對這些突變位點進行致病性分析以及可能導(dǎo)致疾病的推測，共發(fā)現(xiàn)19個可能的致病突變（表2），其中位于第5條染色體上的SPINK5基因的第5外顯子保守區(qū)序列位點發(fā)生了非同義突變c.318G＞A，導(dǎo)致了氨基酸的改變Asp-Asn，從而可能引起內(nèi)瑟頓綜合征（Netherton syndrome）的發(fā)生。

內(nèi)瑟頓綜合征的臨床特征為魚鱗病樣紅皮病、發(fā)干異常和特應(yīng)性素質(zhì)，出生時即出現(xiàn)紅斑，這些癥狀與本研究的患兒臨床癥狀類似。將臨床癥狀結(jié)合基因檢測結(jié)果，初步確定該患兒為攜帶SPINK5基因雜合突變G318A的內(nèi)瑟頓綜合征患者。

4.序列驗證：經(jīng)過PCR擴增，得到了380 bp的目的片段，電泳結(jié)果見圖3。對目的片段進行回收、純化、一代測序，結(jié)果顯示，該患兒的SPINK5基因確實存在G318A的雜合突變（圖4）。

表1 捕獲后血液基因組DNA文庫的qRT-PCR QC結(jié)果

四、討論

2010年，Bilgüvar等［7］運用 NimbleGen 2.1M 芯片捕獲外顯子，并用Genome AnalyzerⅡ測序系統(tǒng)對1例患者測序，發(fā)現(xiàn)WDR62基因與腦皮質(zhì)發(fā)育異常疾病相關(guān)，從而能解釋一系列的嚴(yán)重皮質(zhì)畸形的癥狀，該研究提示，外顯子測序?qū)哂羞z傳異質(zhì)性和診斷亞型困難的疾病有一定幫助。2011年，Worthey等［8］對1例臨床上難以診斷疾病的患兒進行全外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)XIAP（X染色體的細胞凋亡抑制劑）基因上存在非同義突變，對基因功能和涉及代謝通路進行分析，結(jié)合患兒的臨床癥狀，最終確定該患兒所得疾病為難治性炎性腸病。

表2 疑似魚鱗病患兒的致病突變檢測結(jié)果

本研究針對1例臨床上無法準(zhǔn)確判斷其病癥的疑似魚鱗病患兒，采用外顯子組測序技術(shù)，對患兒的血液樣本進行目標(biāo)基因篩選、高通量測序及數(shù)據(jù)分析。外顯子組測序技術(shù)的難點在于探針的設(shè)計，要求探針設(shè)計在維持專一性的同時，能有效捕獲攜帶突變的片段。我們采用的是下面這種很多探針位置交錯，大量起始點不同的探針去雜交捕獲（由于探針是根據(jù)野生型正常序列設(shè)計，有突變序列的雜交效率低于正常序列，這種探針設(shè)計可以有效彌補這一缺陷）（圖2B），可以高效地捕獲發(fā)生變異的目標(biāo)基因片段，定制過程中我們充分考慮了探針的密度和數(shù)量，并對雜交條件進行優(yōu)化，最大可能發(fā)現(xiàn)更多的基因變異信息。

圖3 SPINK5（G318A）突變位點序列PCR擴增電泳結(jié)果 目的片段為380 bp

圖4 SPINK5（G318A）突變位點序列的sanger測序圖譜 對目的片段進行一代測序，發(fā)現(xiàn)SPINK5（G318A）確實存在G318A的雜合突變

外顯子測序的結(jié)果顯示，64 Mbp的目標(biāo)基因長度（符合人外顯子的大?。?、106×的測序深度、99.3%的目標(biāo)區(qū)域覆蓋度以及有超過90.5%的目標(biāo)區(qū)域被覆蓋了30倍以上，已有研究表明，30倍以上的覆蓋度就足夠發(fā)現(xiàn)低頻的SNP、插入/缺失等位點［9-16］，因此這樣的測序深度和覆蓋度足夠發(fā)現(xiàn)發(fā)生頻率很低的突變位點，可以達到預(yù)期的目的。通過對測序所得的SNP位點和Indels進行基因功能注釋和致病性分析，發(fā)現(xiàn)一個已被確定的可以導(dǎo)致內(nèi)瑟頓綜合征的致病突變：SPINK5（G318A）。

內(nèi)瑟頓綜合征是由SPINK5（LEKTI）（皮膚激肽釋放酶級聯(lián)的一種主要抑制劑）中的突變造成的罕有常染色體隱性遺傳性皮膚病，絲氨酸蛋白酶激肽釋放酶（KLK）活性增加已經(jīng)被證明是其臨床癥狀的成因［17］。有文獻證明，患有內(nèi)瑟頓綜合征的患者在編碼LEKTI的SPINK5基因中出現(xiàn)了閱讀框偏移和無義突變［18-20］，LEKTI為具有對抗多種 KLK（包括KLK5、6、7、13 和 14）的活性絲氨酸蛋白酶抑制劑［21-22］，這類基因缺陷會導(dǎo)致抑制結(jié)構(gòu)域的缺失，使在正常的皮膚生理學(xué)中起到關(guān)鍵作用的激肽釋放酶KLK蛋白活性增加，從而引起內(nèi)瑟頓綜合征的發(fā)生。Chavanas等［23］總結(jié)了導(dǎo)致內(nèi)瑟頓綜合征發(fā)生的SPINK5基因突變有13個。2012年，Zhang等［24］在1例中國成年內(nèi)瑟頓綜合征的患者中發(fā)現(xiàn)了SPINK5基因的雜合突變G318A，并通過免疫組化技術(shù)檢測到擁有該突變的個體LEKTI的表達量明顯降低，從而確定SPINK5基因的雜合突變G318A為一新的導(dǎo)致內(nèi)瑟頓綜合征發(fā)生的致病突變。從該疾病的致病機理可以推斷出，給內(nèi)瑟頓綜合征患者補充絲氨酸蛋白酶抑制劑，理論上可以有效控制病癥，具體應(yīng)用需要進一步的功能驗證和臨床試驗。

利用目標(biāo)基因篩選技術(shù)，將全基因組外顯子區(qū)域的序列作為靶向基因，從基因組DNA中篩選出來并進行測序和分析，既可以大幅度降低測序成本，又能增加測序深度和檢測靈敏度，更重要的是，目前一致認為大部分功能變異都潛藏在外顯子中［25］，有機會發(fā)現(xiàn)更多有價值的突變，因此全外顯子組測序的技術(shù)已成為現(xiàn)階段基因測序工作的重心。Biesecker等［26］在 Nature Genetics 發(fā)表評論：外顯子組測序使得醫(yī)學(xué)基因組學(xué)成為現(xiàn)實。我們的研究進一步證實了外顯子組測序技術(shù)作為臨床難以診斷疾病的輔助診療手段的可能性。相信隨著技術(shù)的發(fā)展、測序成本的降低以及后續(xù)分析手段的豐富，預(yù)期在不久的將來，外顯子測序會廣泛被運用到疾病的分子診斷，為臨床一些難以診斷的疾病提供一種新的診斷思路。

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2014-03-27）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.019

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