趙雁 葉郁紅 吳麗賢 方芳 程波

阿維A聯(lián)合克拉霉素對裸鼠移植瘤生長及腫瘤血管生成的影響

趙雁 葉郁紅 吳麗賢 方芳 程波

目的 觀察阿維A聯(lián)合克拉霉素對人口腔表皮樣癌裸鼠移植瘤生長的影響，探討藥物對腫瘤抑制的作用機(jī)制。方法 用人口腔表皮樣癌細(xì)胞建立裸鼠皮下移植瘤模型。采用隨機(jī)雙盲設(shè)計，將31只裸鼠隨機(jī)分6組，對照組、安慰劑組、阿維A組、克拉霉素組、阿維A+安慰劑組、阿維A+克拉霉素組。對照組6只，余各組均為5只裸鼠。各組治療3周后測量移植瘤體積和重量，用RT-PCR檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）mRNA的表達(dá)。對移植瘤體進(jìn)行病理學(xué)分析，采用免疫組化染色檢測各組腫瘤中VEGF、細(xì)胞增殖指數(shù)Ki-67的表達(dá)及其微血管密度（MVD）。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料的均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。結(jié)果 阿維A+克拉霉素組瘤體體積、瘤體重量均低于其他5組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。實(shí)時熒光定量PCR檢測，阿維A+克拉霉素組VEGF、NF-κB mRNA的表達(dá)均低于對照組、克拉霉素組、阿維A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。免疫組化檢測，與對照組、克拉霉素組、阿維A組相比，阿維A+克拉霉素組VEGF表達(dá)率均下調(diào)（均P<0.01），著色淺；MVD顯著降低（均P<0.01），微血管分布較稀疏；Ki-67陽性指數(shù)均降低（均P<0.05），腫瘤細(xì)胞增殖減少。結(jié)論 阿維A聯(lián)合克拉霉素能協(xié)同抑制人口腔表皮樣癌裸鼠移植瘤的生長，并下調(diào)VEGF表達(dá)，抑制血管生成和腫瘤增殖。

異種移植模型抗腫瘤試驗；阿維A；克拉霉素；癌，鱗狀細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子類；NF-κB；Ki-67

我們在臨床中偶然應(yīng)用阿維A聯(lián)合克拉霉素配合CO2激光治愈1例女性面部鱗狀細(xì)胞癌患者［1］。為進(jìn)一步研究它們的抗腫瘤機(jī)制，我們建立了人口腔表皮樣癌裸鼠移植瘤模型，應(yīng)用阿維A和克拉霉素進(jìn)行干預(yù)，觀察瘤體體積、重量、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）的表達(dá)及各組移植瘤體病理變化，免疫組化檢測VEGF表達(dá)率、細(xì)胞增殖指數(shù)Ki-67、微血管密度（microvessel density，MVD）的差異。

一、材料

人口腔表皮樣癌細(xì)胞株（福建醫(yī)科大學(xué)新藥物研究所贈送），RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Amresco公司），Trizol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司），阿維A膠囊（重慶華邦制藥有限公司），克拉霉素（江蘇恒瑞公司），RT-PCR引物（上海鉑尚生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成）。無特定病原體（SPF）級飼養(yǎng)裸鼠，雌性，4～5周齡，體重16～18 g，購于福建醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗室（動物檢疫合格證號：201200056005）。鼠抗人CD34免疫組化單克隆抗體、兔抗鼠VEGF多克隆抗體為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品，鼠抗人Ki-67單克隆抗體為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人口腔表皮樣癌KB腫瘤細(xì)胞生長于RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/L鏈霉素，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。貼壁生長細(xì)胞以0.25%胰酶消化傳代。

2.人口腔表皮樣癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組：裸鼠飼養(yǎng)于恒溫［（25±2）℃］、恒濕（45%～50%）、超凈化生物層流架環(huán)境內(nèi)，定期紫外線消毒，飲水經(jīng)高壓蒸汽滅菌，實(shí)驗操作都在無菌環(huán)境下進(jìn)行。將培養(yǎng)基中人口腔表皮樣癌細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整至1×108/L，在裸鼠背部接種0.2ml，無菌飼養(yǎng)2周，瘤體生長至1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm后開始治療。按臨床實(shí)驗隨機(jī)雙盲標(biāo)準(zhǔn)，加入安慰劑，實(shí)驗員不知治療藥物。裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，對照組、安慰劑組、阿維A組、克拉霉素組、阿維A+安慰劑組、阿維A+克拉霉素組。對照組6只，余各組均為5只裸鼠。將阿維A、克拉霉素及面粉分別溶解于生理氯化鈉溶液，渦旋混勻，分別以灌胃器經(jīng)口將藥直接灌入各組裸鼠胃中，以患者臨床治療劑量換算為裸鼠治療劑量，克拉霉素100 mg·kg-1·d-1，阿維A 7.2 mg·kg-1·d-1，安慰劑為面粉，除對照組外，各組每天給藥1次。3周后處死裸鼠，測量瘤塊體積和重量。

3.實(shí)時定量PCR檢測瘤體中VEGF及NF-κB mRNA的表達(dá)：取20 mg新鮮瘤體，加入Trizol后勻漿，按Invitrogen Trizol說明書提取RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋后進(jìn)行定量PCR檢測。引物序列：VEGF 正向 5′-CATTGGAGCCTTGCCTTG-3′，反向5′-TTCGTGGGGTTTCTGGTCT-3′，產(chǎn)物大小 90 bp；NF-κB 正向 5′-CCGCACCTCCACTCCATCC-3′，反向 5′-ACATCAGCACCCAAGGACACC-3′，產(chǎn)物大小121 bp；內(nèi)參引物GAPDH正向5′-CCGTCTAGAAA AACCTGCC-3′，反向 5′-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3′，產(chǎn)物大小217 bp。實(shí)時定量PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s共40個循環(huán)，60～95℃以5℃為梯度采集熔解曲線。每個實(shí)驗重復(fù)3次。

4.免疫組化檢測移植瘤中VEGF、Ki-67的表達(dá)及其MVD：將人口腔表皮樣癌移植瘤塊以4%多聚甲醛固定，常規(guī)病理切片檢查，免疫組化EnVision法染色。主要步驟：①切片經(jīng)脫蠟、水化；②預(yù)處理組織切片，熱修復(fù)（CD34染色前需用10 mmol/L pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液高壓加熱抗原修復(fù)）；③滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育10min；④加一抗室溫孵育30min，分別加鼠抗人單克隆VEGF（1∶100）、CD34（1 ∶100）、Ki-67（1 ∶100）；⑤加 EnVision 二抗室溫孵育30min。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，顯微鏡下觀察顯色。用已知VEGF、Ki-67陽性乳腺癌和CD34陽性扁桃體組織切片作為陽性對照。光鏡下（×200）觀察，VEGF陽性細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，Ki-67陽性部位為細(xì)胞核內(nèi)棕黃色，每張切片計數(shù)5個視野，觀察不少于1 000個細(xì)胞，分別計算VEGF與Ki-67陽性細(xì)胞百分比。CD34陽性為棕色血管內(nèi)皮細(xì)胞，光鏡下（×200）計數(shù)10個區(qū)域，計數(shù)每個區(qū)域內(nèi)血管數(shù)，取平均數(shù)作為該組瘤塊的MVD。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料的均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.各組裸鼠皮下移植瘤體的體積、重量的比較：裸鼠喂藥3周后處死。各組動物至實(shí)驗結(jié)束時無死亡，均全部進(jìn)入指標(biāo)檢測。測量體重；剝離瘤體稱重和體積測量，結(jié)果見表1。治療后各組移植瘤體積、重量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。組間兩兩比較，阿維A+克拉霉素組瘤體體積、瘤體重量均低于其他各組（均P＜0.05）；阿維A組與克拉霉素組分別與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組裸鼠體重總體比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 裸鼠移植瘤各組經(jīng)治療后移植瘤體積、重量及裸鼠體重比較（±s）

表1 裸鼠移植瘤各組經(jīng)治療后移植瘤體積、重量及裸鼠體重比較（±s）

組別 只數(shù) 瘤體體積（mm3） 瘤體重量（g） 裸鼠體重（g）對照組 6 1750.10±156.76 1.48±0.13 21.64±1.67安慰劑組 5 1745.92±192.21 1.72±0.24 23.09±1.96克拉霉素組 5 1822.34±334.31 1.64±0.47 22.81±0.83阿維A組 5 1470.92±143.65 1.40±0.09 22.18±1.32阿維A+安慰劑組 5 1621.34±195.64 1.45±0.10 22.01±0.36阿維A+克拉霉素組 5 1185.10±177.71 1.12±0.16 21.97±0.76 F值 4.66 3.19 0.52 P值 0.04 0.02 0.76

2.實(shí)時熒光定量PCR檢測瘤體中VEGF、NF-κB mRNA的表達(dá)：治療后對照組、克拉霉素組、阿維A組、阿維A+克拉霉素組瘤體中VEGF、NF-κB mRNA的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.53、6.10，均P＜0.05）。組間兩兩比較，阿維A+克拉霉素組VEGF、NF-κB mRNA的表達(dá)均低于其他各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；阿維A組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；克拉霉素組與對照組比較，VEGF mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而NF-κB mRNA的表達(dá)明顯高于對照組（P＜0.05）。見圖1。

3.移植瘤體的組織學(xué)及免疫組化觀察：組織切片HE染色（圖2），阿維A+克拉霉素組瘤組織排列疏松，瘤細(xì)胞分裂較少，胞質(zhì)豐富，組織中可見到蛋白物質(zhì)及細(xì)胞碎片。其他各組癌巢體積較大，瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核質(zhì)較大，病理性核分裂較多?？死顾亟M見較多單核細(xì)胞。

免疫組化結(jié)果顯示（表2），對照組、克拉霉素組、阿維A組、阿維A+克拉霉素組裸鼠瘤體VEGF、MVD、Ki-67表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與其他3組比較，阿維A+克拉霉素組VEGF表達(dá)率降低（均P＜0.01），著色淺；MVD顯著降低（均P＜0.01），微血管分布較稀疏；Ki-67陽性指數(shù)均低于其他3組（均P＜0.05），腫瘤細(xì)胞增殖減少。阿維A組與對照組比較，VEGF、MVD和Ki-67均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；克拉霉素組與對照組比較，VEGF、MVD和Ki-67的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 裸鼠移植瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和核轉(zhuǎn)錄因子 κB（NF-κB）mRNA 相對表達(dá)量

表2 裸鼠移植瘤瘤體血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、微血管密度（MVD）、Ki-67表達(dá)（%，±s）

表2 裸鼠移植瘤瘤體血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、微血管密度（MVD）、Ki-67表達(dá)（%，±s）

組別 只數(shù) VEGF MVD Ki-67對照組 5 78.21±2.83 6.40±1.14 82.34±2.35克拉霉素組 5 81.45±3.57 5.80±0.84 78.43±3.07阿維A組 5 69.77±2.58 4.40±0.55 64.56±2.45阿維A+克拉霉素組 5 53.64±3.04 2.00±0.71 48.72±3.46 F值 20.32 27.31 28.49 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

四、討論

研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)腫瘤組織中已有和（或）正在形成的血管，阻斷血管生成的通路，能夠有效抑制腫瘤生長和增殖，使其處于休眠狀態(tài)［2］。有研究表明，抑制移植瘤中VEGF的表達(dá)即血管生成，可抑制腫瘤的生長［3］。有研究表明，NF-κB與鱗狀細(xì)胞癌、黑素瘤、結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)［4］，還在抗細(xì)胞凋亡中起著重要作用［5］。抑制NF-κB、VEGF靶向治療的新型藥物與惡性腫瘤治療策略是目前研究熱點(diǎn)［3，6］。

體外實(shí)驗［7-8］表明，阿維A能抑制鱗癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)鱗癌細(xì)胞的凋亡。溫炬等［9］的研究顯示，銀屑病患者經(jīng)阿維A治療后，皮損的MVD值、VEGF蛋白的表達(dá)及血清中VEGF水平較治療前明顯減低。Mikasa等［10］應(yīng)用克拉霉素治療非小細(xì)胞肺癌。Yatsunami等［11］研究表明，羅紅霉素和克拉霉素有抑制小鼠B16BL6黑素細(xì)胞瘤生長的作用。腫瘤組織中的MVD是間接測量腫瘤血管生成的指標(biāo)之一，它與多種腫瘤的臨床分期、病理分級以及預(yù)后有關(guān)［12］。

人口腔表皮樣癌裸鼠移植瘤具有惡性腫瘤原位移植的特點(diǎn)，接近惡性實(shí)體腫瘤的組織學(xué)特征，可以更好地模擬臨床惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療的過程。臨床中我們觀察到阿維A聯(lián)合克拉霉素對皮膚實(shí)體惡性腫瘤有抑制作用，但無法證實(shí)兩者的協(xié)同作用。我們在裸鼠體內(nèi)進(jìn)一步研究阿維A聯(lián)合克拉霉素藥物抗腫瘤作用機(jī)制。結(jié)果表明，阿維A聯(lián)合克拉霉素組VEGF、MVD、Ki-67表達(dá)都明顯低于對照和單獨(dú)用藥組。移植瘤瘤體體積、重量、實(shí)時熒光定量PCR檢測的VEGF、NF-κB mRNA表達(dá)結(jié)果與免疫組化顯示的血管生成、組織增殖表達(dá)結(jié)果基本一致，表明阿維A聯(lián)合克拉霉素對人口腔表皮樣癌移植瘤比單獨(dú)用藥和對照組有明顯的抑制作用，并且可以下調(diào)VEGF和NF-κB的表達(dá)，抑制血管生成。與對照組比較，阿維A組免疫組化檢測VEGF、MVD、Ki-67表達(dá)均明顯降低，但瘤體體積、重量及VEGF、NF-κB mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明阿維A抗腫瘤血管生成作用先于瘤體重量、體積等指標(biāo)出現(xiàn)。阿維A聯(lián)合克拉霉素組所有觀察指標(biāo)均低于阿維A組，證實(shí)兩者聯(lián)合用藥有抗腫瘤的協(xié)同作用。

本實(shí)驗中，我們觀察到阿維A與克拉霉素的聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)了藥物抗血管增生的作用，抑制了血管因子水平和腫瘤生長。我們從臨床逆向?qū)嶒炇已芯?，可以驗證臨床觀察到阿維A聯(lián)合克拉霉素聯(lián)合應(yīng)用后，腫瘤體積縮小。但這只是實(shí)驗研究的初步探討，還需要深入的后續(xù)研究。

圖2 各組裸鼠移植瘤組織病理學(xué)觀察（HE×200） 阿維A+克拉霉素組瘤組織排列疏松，瘤細(xì)胞分裂較少，胞質(zhì)豐富，組織中可見到蛋白物質(zhì)及細(xì)胞碎片。其他各組腫瘤癌巢體積較大，瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核質(zhì)較大，病理性核分裂較多?？死顾亟M見較多單核細(xì)胞

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2014-05-06）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

Effects of acitretin combined with clarithromycin on tumor growth and angiogenesis in human oral epidermoid carcinoma xenografts in nude mice

Zhao Yan*，Ye Yuhong,Wu Lixian,Fang Fang,Cheng Bo.*First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fujian Provincial Institute of Dermatology，F(xiàn)uzhou 350009，China

Cheng Bo,Email:chengbofj@gmail.com

ObjectiveTo evaluate the effects of acitretin combined with clarithromycin on tumor growth in human oral epidermoid carcinoma xenografts in nude mice,and to investigate their antitumor mechanisms.MethodsA cell line of human oral epidermoid carcinoma was subcutaneously inoculated into 31 Balb/c nude mice to establish a xenograft model of human skin tumor.Then,the nude mice were randomly classified into 6 groups according to a double blind protocol:control group（n=6）remaining untreated,placebo group（n=5）treated with wheat flour,acitretin group（n=5）treated with acitretin 7.2 mg/kg per day,clarithromycin group（n=5）treated with clarithromycin 100 mg/kg per day,acitretin+placebo group （n=5）treated with both acitretin （7.2 mg/kg per day）and wheat flour,and acitretin+clarithromycin group （n=5）treated with acitretin （7.2 mg/kg per day）and clarithromycin 100 mg/kg per day.All the drugs were intragastrically administrated once daily.After three weeks of treatment,mice were sacrificed and xenografts were removed.Then,the size and weight of xenografts were measured,and pathological analysis was conducted.Real time-PCR was performed to quantify the mRNA expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF）and nuclear factor （NF）-κB,and immunohistochemistry was carried out to observe the expression of VEGF as well as to determine microvessel density（MVD）and Ki-67 proliferation index.By using the software SPSS 19.0,analysis of variance was performed for comparison of measurement data,and least significant difference （LSD）test for paired comparisons.ResultsBoth the size and weight of xenografts in the acitretin+clarithromycin group were significantly lower than those in the other groups （allP<0.05）.Real-time fluorescence-based PCR revealed weaker mRNA expressions of VEGF and NF-κB in the acitretin+clarithromycin group compared with the control group,clarithromycin group and acitretin group （allP<0.05）.As immunohistochemistry showed,the acitretin+clarithromycin group displayed a decrease in the expression rate （allP<0.01）and staining intensity of VEGF,MVD （allP<0.01）with a sparse distribution of microvessels,Ki-67 proliferation index（allP<0.05）and proliferative activity of tumor cells compared with the control group,clarithromycin group and acitretin group.Conclusion Acitretin combined with clarithromycin can synergistically inhibit the growth of human oral epidermoid carcinoma xenografts in nude mice,downregulate VEGF expression,and suppress angiogenesis and tumor proliferation.

Xenograft model antitumor assays;Acitretin;Clarithromycin;Carcinoma,squamous cell;Vascular endothelial growth factors;NF-kappa B;Ki-67

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.016

福建省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題（2011-CXB-11）

350009福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建省皮膚病研究所（趙雁、方芳、程波），病理研究室（葉郁紅）；福建醫(yī)科大學(xué)新藥物研究所（吳麗賢）

程波，Email：chengbofj@gmail.com