龍 兵,羅 楊,皮建華,周 豪

（1.四川警察學院 四川瀘州 646000；2.瀘州市公安局 四川瀘州 646000）

案發(fā)時間的判斷對于案件的偵破具有十分重要的意義。血痕是現(xiàn)場非常常見的生物物證，通常能夠比較準確地反映案發(fā)時間。血痕遺留時間的推斷一直是刑事科學技術(shù)領域研究的熱點和難點[1-4]。

RNA是分子生物學領域的研究熱點，同時受到法醫(yī)學研究者的關注。許多研究報道機體組織RNA會隨著死亡時間的延長而發(fā)生降解，降解與死亡時間具有一定的相關性[5-7]。這些研究大多以組織器官為研究對象，關于血痕RNA降解的研究相對較少。本次研究以管家基因β-actin和血液中特異性表達的HBB為目的基因，18s rRNA為內(nèi)參基因，探討血痕在離體72小時時間內(nèi)mRNA的降解情況。

一、材料與方法

（一）樣本。

采集6名個體靜脈血（3名男性，3名女性），各1mL，EDTA抗凝。取20μL血液滴于吸水濾紙上，共制作42份樣本，室溫保存，分別于0.5h、2h、6h、12h、24h、48h、72h后提取RNA。

（二）儀器與試劑。

采用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取RNA。采用Bioneer逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。實時定量PCR擴增采用的試劑盒為Roche公司FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)熒光定量試劑盒，擴增儀器為AB-7500實時定量PCR儀。

（三）方法。

1.RNA抽提。剪取制作的血痕于1.5mL離心管，加入0.5mLTRIzol試劑，室溫下震蕩混勻5min，加0.1mL氯仿，混勻，放置3min； 12000g離心15min；取上清，加入250μL異丙醇，混勻，12000g離心10min；棄上清，加入75%乙醇1mL，7500g離心5min。棄上清，短暫室溫干燥，加入DEPC水溶解，-80保存。實驗操作均在冰上進行，離心均為-4℃低溫離心。

2.RNA逆轉(zhuǎn)錄。反應體系為5μL模板RNA,基因特異性逆轉(zhuǎn)錄引物濃度為20pmol，總反應體系為20μL。 反應條件為50℃保溫1h，95℃變性5min。

表1 逆轉(zhuǎn)錄基因特異性引物

3.實時定量PCR。HBB、β-actin和18s rRNA的擴增引物見表2。實時熒光定量PCR擴增反應體系：5μL SYBR Green,前后引物終濃度均為0.5μM，總反應體系為10μL。

表2 HBB、β-actin和18s rRNA擴增引物

擴增條件為：

?

（四）數(shù)據(jù)分析。

以實時定量PCR的CT值進行統(tǒng)計學處理，分析軟件為Excel2007、GraphPad Prism5。

二、結(jié)果

（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測PCR擴增片段，片段大小與預期大小相符合，見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

從左至右分別為Marker、18s rRNA、β-actin、HBB。

（二）RNA降解與血痕遺留時間的相關性。

獲得各樣本實時定量PCR擴增CT值，HBB、18s rRNA、β-actin實時定量PCR擴增曲線見圖2。

圖2 實時定量PCR擴增曲線

從左至右分別為HBB、18s rRNA、β-actin。

以18s rRNA為內(nèi)參計算ΔCT值，即ΔCT=CT（target mRNA）-CT(reference DNA)[8]，建立ΔCT值與血痕遺留時間的相關性。結(jié)果顯示在72小時時間內(nèi)，血痕β-actin、HBB基因mRNA具有較強的穩(wěn)定性，mRNA降解與血痕遺留時間沒有相關性（p＞0.05）。HBB、β-actin基因mRNA降解與血痕遺留時間的相關性見圖3、圖4。

圖3 HBB基因mRNA降解與血痕遺留時間相關性（r=0.4325,p=0.3324）

圖4 β-actin基因mRNA降解與血痕遺留時間相關性（r=0.3985,p=0.3759）

三、討論

RNA在細胞內(nèi)以多種形式存在，主要包括mRNA、tRNA、rRNA等。18s rRNA與核糖體蛋白緊密結(jié)合，受到核糖體蛋白的保護，穩(wěn)定性強，不易發(fā)生降解[9]。許炎等[10]，在研究中發(fā)現(xiàn)血痕18s rRNA在8-15天都沒有發(fā)生明顯降解。研究中，我們以18s rRNA為內(nèi)參對HBB和β-actin兩個目的基因CT值進行標準化處理，能夠更加準確的觀察血痕mRNA的降解情況，更好的反映mRNA降解與血痕遺留時間的相關性。

許多研究報道機體死亡后細胞mRNA在數(shù)天甚至數(shù)小時內(nèi)發(fā)生快速降解[7,11]。我們在研究中發(fā)現(xiàn)血痕HBB和β-actin基因mRNA在72小時時間內(nèi)都保持了很強的穩(wěn)定性，這與機體在死亡后細胞mRNA降解有很大差異。我們認為導致血痕mRNA降解速度慢的原因，一方面可能與血痕在濾紙上迅速干燥，RNA酶以及相關因子的活性降低有關；另一方面，可能與實驗環(huán)境相對理想化，受到外界的污染相對較小有關。該研究涉及的血痕遺留時間相對較短，在以后的研究中，我們將進一步延長血痕遺留時間，同時探討溫度、濕度等因素對血痕RNA降解的影響。

[1]Bremmer RH,De Bruin KG,Van Gemert MJ,et al.Forensic quest for age determination of bloodstains[J].Forensic science international,2012,216(1-3):1-11.

[2]Anderson SE,Hobbs GR,Bishop CP.MμLtivariate analysis for estimating the age of a bloodstain[J].Journal of forensic sciences,2011,56(1):186-193.

[3]Anderson S,Howard B,Hobbs GR,et al.A method for determining the age of a bloodstain[J].Forensic science international,2005,148(1):37-45.

[4]Bauer M,Polzin S,Patzelt D.Quantification of RNA degradation by semi-quantitative duplex and competitive RTPCR:a possible indicator of the age of bloodstains?[J].Forensic science international,2003,138(1-3):94-103.

[5]朱 怡,董迎春,梁偉波,等.2011-小鼠死后腦RNA降解與死亡時間的相關性[J].法醫(yī)學雜志,2011,26(3):161-163.

[6]Young ST,Wells JD,Hobbs GR,et al.Estimating postmortem interval using RNA degradation and morphological changes in tooth pμLp[J].Forensic science international,2013,229(1-3):e161-166.

[7]Sampaio-Silva F,Magalhaes T,Carvalho F,et al.Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval[J].PloS one,2013,8(2):e56507.

[8]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔCT Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[9]Houseley J,Tollervey D.The many pathways of RNA degradation[J].Cell,2009,136(4):763-776.

[10]許 炎,蔣 巍,平 原,等.應用RNA分析技術(shù)推斷現(xiàn)場血痕形成時間[J].法醫(yī)學雜志,2010,26(5):340-342.

[11]Deng W,Lv M,Wang L,et al.mRNA degradation pattern analysis in post-mortem normalized using the DNA[J].Forensic Science International:Genetics Supplement Series,2013,4(1):e266-e267.