李運書，孟祥碩，崔 策，嚴美悅，王春艷?

（1.承德醫(yī)學院2012級麻醉本科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學院2011級麻醉本科；3.承德醫(yī)學院2012級中西醫(yī)臨床本科；4.指導教師）

葉酸對胚胎大鼠心肌細胞凋亡及Bax、Bcl-2表達的影響

李運書1，孟祥碩2，崔 策1，嚴美悅3，王春艷4?

（1.承德醫(yī)學院2012級麻醉本科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學院2011級麻醉本科；3.承德醫(yī)學院2012級中西醫(yī)臨床本科；4.指導教師）

葉酸；胚胎；大鼠；心??；細胞凋亡；Bax；Bcl-2

先天性心臟病發(fā)病率約為4.05%-12.30%，是我國城市0-5歲嬰幼兒死亡的首要原因［1］。葉酸應用于預防心臟畸形始于20世紀90年代，但其作用機制尚未明確［2］。細胞凋亡是與增殖相反的細胞活動，胚胎細胞適度和適量的凋亡是器官外形正常建立的基礎。本研究給予孕鼠葉酸干預，觀察對胎鼠心肌細胞凋亡率、Bax、Bcl-2表達的影響，探討葉酸對胎鼠心臟發(fā)生、發(fā)育過程中細胞凋亡的作用，為葉酸預防先天性心臟畸形的機制及安全劑量研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、分組、給藥 10周齡健康清潔級SD大鼠，體重210-250g（北京大學醫(yī)學部動物中心提供）。動物室室溫為22±2℃，濕度45±5%，普通飼料喂養(yǎng)，自由攝水。大鼠隨機分為小、中、大劑量葉酸組和對照組，每組10只。適應性喂養(yǎng)1周后， 按雌雄2：1比例合籠，次晨查陰栓，陽性者即確定受孕。從受孕日起，大、中、小劑量葉酸組分別灌胃給予葉酸（上海生物化學制品廠）2mg/kg/d、1mg/kg/d、0.5mg/kg/d。對照組灌服等量生理鹽水。

1.2 取材及制片 各組孕鼠均于ED13.5處死，每只孕鼠隨機取2只胎鼠的心臟，常規(guī)固定包埋，連續(xù)切片。每隔10張取7張（1套），每1心臟取10套，裱貼于APES載物片上，待染。

1.3 染色 免疫組化染色采用SP法，經過抗原修復、滴加一抗、二抗、三抗，DAB顯色，蘇木素復染。Mivnt顯微圖像分析系統(tǒng)對切片陽性物質進行定量分析。

1.4 TUNEL末端標記法 切片常規(guī)脫蠟至水、消除內源性過氧化物酶、加入新鮮配制的TUNEL反應液，DAB顯色，蘇木素復染。TUNEL凋亡檢測試劑盒、Bax、Bcl-2一抗、免疫組化試劑盒均購自中杉金橋生物公司。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計處理，葉酸干預影響采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胎鼠心肌細胞凋亡率 各組胎鼠均可見凋亡陽性心肌細胞，其細胞核呈棕褐色。葉酸干預組細胞調亡率較對照組明顯降低（P＜0.01）。不同劑量葉酸組間比較，大、中劑量組較小劑量組顯著降低（P＜0.05）；大劑量組與中劑量組比較無明顯差異（P＞0.05）（見附表）。結果提示，葉酸具有抑制胚胎心肌細胞凋亡的作用，且葉酸抗凋亡作用與劑量有關。

2.2 胎鼠心肌細胞Bax、Bcl-2的表達 Bax和Bcl-2在各組胎鼠心肌細胞均有表達，陽性物質呈棕黃色顆粒狀，多位于細胞漿內，少數(shù)胞漿和胞核同時表達。葉酸干預組Bax表達明顯低于對照組（P＜0.01）， Bcl-2表達顯著高于對照組（P

＜0.05），提示葉酸能抑制Bax表達，提高Bcl-2的表達。不同劑量組間比較，大、中劑量組Bax和Bcl-2表達與小劑量組比較差異顯著（P＜0.05）；大劑量組與中劑量組比較無明顯差異（P＞0.05）（見附表）。不同劑量組表達量的不同，提示劑量大小與葉酸調節(jié)Bax、Bcl-2表達的作用程度有關。

附表 各組胎鼠心肌細胞凋亡率和Bax、Bcl-2表達（±s，n=10）

附表 各組胎鼠心肌細胞凋亡率和Bax、Bcl-2表達（±s，n=10）

與對照組比較：aP＜0.01，bP＜0.05；與小劑量組比較：cP＜0.05；與中劑量組比較：dP＞0.05

組別 凋亡率（%） Bax Bcl-2對照組 24.8±6.47 0.24±0.036 0.19±0.061小劑量組 16.19±3.03a0.18±0.045a0.26±0.044b中劑量組 11.13±3.83ac0.13±0.032ac0.37±0.035bc大劑量組 10.28±3.66acd0.11±0.027acd0.39±0.037bcd

3 討論

細胞凋亡是解決胚胎器官發(fā)生、外形雕刻的重要細胞生物學事件。與增殖一樣，胚胎細胞凋亡的發(fā)生時間、強弱在各種凋亡相關基因（如Bax、Bcl-2、P16等）的嚴格調控下進行［3］。目前認為，原癌基因Bcl-2是主要的抗凋亡基因，可以抑制多種轉導途徑的凋亡。Bax與Bcl-2功能完全相反，且是Bcl-2的拮抗基因， 通過編碼相應功能蛋白起作用［4］。Bax與Bcl-2既能各自形成同源二聚體，又能互相作用形成異源二聚體，共同調節(jié)細胞凋亡。

本研究通過灌胃給予受孕大鼠不同劑量葉酸，發(fā)現(xiàn)葉酸明顯降低了胎鼠心肌細胞Bax的表達、提高了Bcl-2的表達。結合TUNEL標記結果，葉酸干預組胎鼠心臟凋亡細胞率降低，共同提示葉酸可能通過調節(jié)Bax、Bcl-2兩種凋亡調節(jié)基因的表達，進而降低胎鼠心肌細胞的凋亡。Bax、Bcl-2之間表達平衡的改變，可能是葉酸拮抗心肌細胞凋亡作用的分子機制之一。本研究結果與Wu等［5］一致，他們發(fā)現(xiàn)補充葉酸能顯著減少STZ誘導的糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的發(fā)生。關濤等［6］學者在研究畸形發(fā)生機制時發(fā)現(xiàn)，應用PMX誘導實驗動物發(fā)生NTD，其機制可能與PMX阻斷了葉酸的代謝通路、導致神經上皮細胞過度凋亡有關，這與本研究結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著葉酸濃度的增加，胎鼠心肌細胞凋亡率按對照組、小、中、大劑量葉酸干預組順序呈逐漸下降趨勢，提示劑量大小與葉酸調節(jié)心肌細胞凋亡的作用程度有關。

總之，葉酸可降低胎鼠心肌細胞促凋亡因子Bax的表達、提高抑凋亡因子Bcl-2的表達，并降低胎鼠心肌細胞的凋亡率。一定劑量范圍內，葉酸下調Bax、上調Bcl-2表達及降低凋亡率的作用與劑量有關。葉酸預防畸形的作用機制可能與抑制心肌細胞凋亡、調節(jié)凋亡基因的表達有關。

［1］吳明昌.先天性心臟病在圍生期的評估［J］.中國醫(yī)刊，2002，37（1）：4-6.

［2］楊江帆，楊戎威，李瑋，等.葉酸預防先天性心臟病的作用［J］.中國新生兒科雜志，2007，2（3）：129-132

［3］于素香，孫玉國，王春艷.葉酸對妊娠大鼠胎盤細胞PCNA表達的影響［J］.承德醫(yī)學院學報，2012，29（2）：128-130.

［4］Pickell L， Brown K， Li D， et al. High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice［J］. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol， 2011，91（1）：8-19.

［5］Wu TG，Li WH，Lin ZQ，et a1.Effects of folic acid on cardiacmyocyte apoptos is in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus［J］.Cardiovasc Drug Ther.2008，22（4）：299-304.

［6］關濤，王秀偉，官臻，等.PMX誘導神經管畸形及其對神經上皮細胞增殖和凋亡的影響［J］.神經解剖學雜志，2011，27（4）：447-452.

（學生園地欄目編輯：張 ?。?/p>

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1004-6879（2015）03-0259-03

2015-04-02）