鐘潔霞

（江門市人民醫(yī)院藥劑科，廣東江門 529000）

基礎醫(yī)學

丹紅注射液對血脂異?；颊邇绕ぷ婕毎δ芎蛿盗康挠绊?/p>

鐘潔霞

（江門市人民醫(yī)院藥劑科，廣東江門 529000）

目的：觀察丹紅注射液對血脂異?；颊邇绕そM細胞（EPCs）功能和數量的影響。方法：160例血脂異?；颊唠S機分為治療組80例和對照組80例，對照組采取常規(guī)治療，治療組在對照組的基礎上加用丹紅注射液，療程為10d。療程結束后取外周血EPCs進行培養(yǎng)，采用流式細胞術、倒置顯微鏡、MTT法和Boyden小室等鑒定EPCs，并觀察EPCs的黏附能力、增殖能力、遷移能力、克隆形成能力和數量。結果：丹紅注射液能顯著提高血脂異?；颊咄庵苋狤PCs的黏附能力、增殖能力、遷移能力、克隆形成能力和數量（P＜0.01，P＜0.05）。結論：丹紅注射液可能通過改善血脂異常患者EPCs的功能保護心腦血管。

丹紅注射液；血脂異常；內皮組細胞（EPCs）

內皮祖細胞（EPCs）是指機體中能夠分化成內皮細胞的一群干/祖細胞，該細胞能特異性歸巢于血管損傷及血管新生部位，參與修復血管內膜的損傷、防治早期動脈粥樣硬化和血管成形術后再狹窄。血脂異常是動脈粥樣硬化、腦血管意外、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的重要危險因素，相關研究發(fā)現血脂異常患者外周血中EPCs的功能受損，且數量減少［1］。因此，尋找有效藥物動員體內EPCs，增加其數量，以及改善外周血EPCs的功能，已成為動脈粥樣硬化、腦血管意外、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的一個研究新領域。丹紅注射液系中藥丹參、紅花的提取物，具有活血祛瘀、通脈疏絡的功效，臨床上主要應用于腦血栓、缺血性腦病、瘀血型肺心病、心肌梗死、冠心病心絞痛等疾病的治療。相關研究表明，丹紅注射液具有抗血小板聚集及黏附、抑制血栓形成、改善血液流變學等作用，但現階段對該藥的研究僅局限于動物離體器官和整體水平，尚未深入細胞及分子水平，缺乏循證醫(yī)學的支持［2］。本研究通過觀察血脂異?；颊呤褂玫ぜt注射液治療后EPCs功能和數量的變化，以從細胞層面明確丹紅注射液的作用機制。

1 資料與方法

1.1 診斷標準及納入、排除標準 ⑴診斷標準：參照《中國成人血脂異常防治指南》（中國成人血脂異常防治指南制定聯(lián)合委員會于2007年制定）［3］。⑵納入標準：符合上述診斷標準者。⑶排除標準：①不符合納入標準者；②不配合治療及中斷治療者；③過敏體質及對藥物過敏者；④合并影響EPCs的疾病，如外傷、視網膜病變、外科手術、感染、惡性腫瘤等；⑤合并嚴重的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)疾病的患者；⑥伴有嚴重并發(fā)癥。

1.2 一般資料 2010年1月至2014年8月于我院治療的血脂異?；颊?60例，隨機分為治療組80例和對照組80例。治療組，男38例，女42例；病程9個月-5年；年齡48-73歲，平均（57±8）歲。對照組，男41例，女39例；病程10個月-4.5年；年齡47-75歲，平均（58±7）歲。兩組患者性別、病程、年齡方面比較，差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性（P＞0.05）。

1.3 實驗材料 丹紅注射液（山東丹紅制藥有限公司，規(guī)格：10ml/支，批號：14051033），Boyden小室（江蘇海門麒麟儀器廠），纖維連接蛋白（北京索萊寶科技有限公司），血管內皮生長因子（VEGF，上海酶聯(lián)生物科技有限公司），Ⅷ因子免疫組化相關抗原試劑盒（上海領潮生物科技有限公司），MTT（上海勵瑞生物科技有限公司），PE-CD34（美國貝克曼庫爾特有限公司分公司），PEVEGFR-2、FITC-AC133（北京達科為生物技術有限公司），胎牛血清、胰酶、M199、PBS、ECSG、Hank's液（上海撫生實業(yè)有限公司），DiI-ac-LDL（北京博蕾德生物科技有限公司）。

1.4 治療方法 對照組給予降血脂、抗血小板聚集、擴張血管等常規(guī)治療；治療組在對照組的基礎上加用丹紅注射液，30ml溶于0.9%生理鹽水或5%葡萄糖注射液中靜脈滴注，療程為10d，1次/d。療程結束后，兩組患者分別抽取空腹全血20ml，取其中的EPCs進行培養(yǎng)。

1.5 EPCs培養(yǎng)及相關實驗

1.5.1 EPCs培養(yǎng)：采用離心密度梯度法，取20ml全血分離單個核細胞，纖維連接蛋白包被24孔培養(yǎng)皿，將1ml含20%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的M199加入培養(yǎng)皿，將分離的單個核細胞以5×106個/cm2接種于培養(yǎng)皿，37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3d后洗去未貼壁細胞，添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)［4］。

1.5.2 EPCs的鑒定：培養(yǎng)6d后的EPCs使用0.25%的胰酶消化，制成1×106個/ml的單個細胞懸液，加入10 μl（1mg/ml）熒光標記的CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2、AC133，使用流式細胞儀分析細胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2和AC133的表達。在避光環(huán)境下，將細胞與DiI-ac-LDL（2.4μg/ml）孵育4h，洗去培養(yǎng)液，于熒光顯微鏡下觀察細胞熒光；以不加DiI-ac-LDL的同批培養(yǎng)細胞作為空白對照，以細胞吞噬DiI-ac-LDL作為培養(yǎng)驗證。培養(yǎng)2w后進行Ⅷ因子相關抗原檢測，培養(yǎng)細胞采用免疫組化法，空白對照不加一抗，陰性對照采用GSC7901（胃癌細胞株）［5］。

1.5.3 檢測EPCs的黏附能力：收集貼壁細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，懸浮在500 μ l培養(yǎng)液中，計數。纖維連接蛋白包被培養(yǎng)板，設定培養(yǎng)溫度為37℃，接種同等數目的EPCs培養(yǎng)30min，洗去未貼壁細胞，倒置顯微鏡下隨機選取10個視野（×200），計算黏附細胞數［5］。

1.5.4 檢測EPCs的增殖能力：收集貼壁細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，懸浮在500 μl培養(yǎng)液中，計數。纖維連接蛋白包被96孔培養(yǎng)板，每孔加10 μ l MTT（5mg/ml），并接種等量EPCs，培養(yǎng)4h后棄去上清，加入二甲基亞砜（150μl/孔），于微量振蕩器充分振蕩10min后使用酶標儀檢測A490值［6］。

1.5.5 檢測EPCs的遷移能力：按1.5.4的方法收集細胞并計數。在改良的Boyden小室上室中注入2×104個EPCs和150 μl培養(yǎng)液，于下室中加入VEGF（50ng/ml）和100 μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后刮去濾膜上未移動的細胞，甲醇固定后Giemsa染色，隨機選取鏡下視野（×200）5個，計算遷移到下室的細胞［7］。

1.5.6 檢測EPCs的克隆形成能力：倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)4d后的典型細胞團，外周為紡錘形細胞，向外擴散，中間為大量的圓形細胞，層層疊疊，將1個集落定義為＞50個細胞的細胞團，在培養(yǎng)皿上、下、左、右、中5個方位各隨機取1個視野（×40）取均值計算集落數［4］。

1.5.7 檢測EPCs的數量：取制成1×106個/ml單個細胞懸液，各加入10 μl（1mg/ml）熒光標記的CD34和AC133，用流式細胞儀檢測細胞CD34和AC133的表達，使用Quest軟件分析計算雙陽性細胞。

1.6 統(tǒng)計分析 使用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，對所有實驗數據進行正態(tài)分布檢驗，行獨立樣本的t檢驗。

2 結果

2.1 EPCs鑒定 培養(yǎng)3d后洗去不貼壁的細胞和碎片，可見典型細胞集落：略高于培養(yǎng)平面，向外擴散，中間為大量的圓形細胞，外周為紡錘形細胞，呈白色半透明，層層疊疊。6d后流式細胞儀分析顯示，所培養(yǎng)的細胞表達CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2和AC133。熒光顯微鏡鏡檢：隨培養(yǎng)時間的延長，越來越多的DiI-ac-LDL被細胞所吞噬，并于顯微鏡下激發(fā)灰色熒光；而空白對照、陰性對照組均無熒光。培養(yǎng)2w，免疫組化結果提示Ⅷ因子相關抗原呈陽性，胞漿為棕色，空白對照和陰性對照不著色。

2.2 丹紅注射液對EPCs功能和數量的影響 與對照組相比，丹紅注射液能夠增加全血EPCs的黏附能力、增殖能力、遷移能力、克隆數和數量，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見附表：

附表 丹紅注射液對全血EPCs功能和數量的影響（±s）

附表 丹紅注射液對全血EPCs功能和數量的影響（±s）

組別 黏附細胞（個） A490 遷移細胞（個） 克隆數（個） EPCs數量（×103個/ml）治療組 14.82±2.35 0.31±0.03 18.21±2.19 5.98±0.61 10.81±1.05對照組 9.41±2.15 0.19±0.03 10.98±2.15 3.21±0.59 6.01±1.06 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05

3 討論

血脂異常是動脈粥樣硬化、腦出血、腦梗塞、冠心病等心腦血管疾病的重要危險因素，該類患者血中過高的ox-LDL能夠氧化損傷內皮細胞、誘導內皮細胞凋亡，從而導致內皮功能障礙，而損傷內皮的再內皮化能夠減少平滑肌細胞的增殖和新內膜的厚度。有研究表明，EPCs參與了再內皮化［8］。

EPCs能參與體內血管內膜的修復，可促進缺血性心腦血管病時的血管新生［9-10］。相關研究顯示，EPCs的數目在具有心腦血管病高危因素患者全血中明顯減少，且更容易衰老，內皮損傷在缺少EPCs的情況下明顯加重，從而影響心腦血管疾病的進展。因此，與傳統(tǒng)的心腦血管病危險因素相比，EPCs是評價心腦血管功能的一個有效指標。作為內皮細胞的同一譜系，EPCs的功能和數量同樣受到血脂異常的影響，可能與ox-LDL直接損傷EPCs、增加EPCs凋亡和影響EPCs的分化和動員有關［11］。由此推測，通過恢復血脂異?；颊逧PCs的功能、增加EPCs的數量，能夠有效降低血脂異?；颊邉用}粥樣硬化、腦出血、腦梗塞以及冠心病的風險。

丹紅注射液是采用現代科學方法和技術研制的中成藥注射液，主要有效成分為兒茶酚、紅花酚苷、紅花黃色素、丹參酚酸、丹參酸、丹參酮等，具有改善微循環(huán)、促進纖維蛋白溶解、改善血液流變學、保護心肌損傷、抗血栓形成、減少血小板黏附和聚集、抗動脈粥樣硬化等作用［12］。研究發(fā)現，丹紅注射液的心腦血管保護作用可能與降低血漿hs-CRP、sP-sel、ET-1水平［13］；降低腦組織MDA含量、MAO活力，提高SOD活性［14］；降低血清MMP-9水平［15］等有關。本研究證實，丹紅注射液能顯著提高血脂異?；颊咄庵苎狤PCs的功能和數量，從細胞層面為丹紅注射液保護心腦血管的機制提供了新的依據，具有重要意義。

鑒于EPCs與內皮細胞同屬于內皮譜系，本研究推測丹紅注射液可能通過抑制炎癥因子表達、抑制EPCs凋亡、抗氧化等實現對EPCs的保護作用，但具體機制尚待進一步研究揭示。

［1］季亢挺，張懷勤，李海鷹，等.高膽固醇血癥患者外周血內皮細胞的變化及丹參的保護作用［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2007，25（6）：1173-1175.

［2］王宇翎，張艷，李前進.注射用丹紅對大鼠血液流變學及血栓、血小板功能的影響［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2012，47（4）：419-421.

［3］中國成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會.中國成人血脂異常防治指南［J］.中華心血管病雜志，2007，35（5）：390-419.

［4］季亢挺，張懷勤，唐積肥，等.丹參對高膽固醇血癥患者內皮祖細胞數量及功能的影響［J］.中國中藥雜志，2007，32（12）：1214-1217.

［5］Werner N， Junk S， Laufs U， et al. Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury［J］. Circ Res， 2003， 93（2）： e17-24.

［6］朱軍慧，王興祥，陳君柱，等.高膽固醇對內皮祖細胞數量和功能的影響［J］.中華內科雜志，2004，43（4）：261-264.

［7］Vasa M， Fichtlscherer S， Aicher A， et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease［J］. Circ Res，2001， 89（1）： E1-7.

［8］Griese DP， Ehsan A， Melo LG， et al. Isolation and transplantation of autologous circulating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts： implications for cell-based vascular therapy［J］. Circulation， 2003， 108（21）： 2710-2715.

［9］Kawamoto A， Gwon HC， Iwaguro H， et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia［J］. Circulation， 2001， 103（5）： 634-637.

［10］Kawamoto A， Tkebuchava T， Yamaguchi J， et al. Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia［J］. Circulation， 2003， 107（3）： 461-468.

［11］Hill JM， Zalos G， Halcox JP， et al. Circulating endothelial progenitor cells， vascular function， and cardiovascular risk［J］. NEngl J Med， 2003， 348（7）： 593-600.

［12］王桂英.丹紅注射液臨床應用研究現狀［J］.天津藥學，2012，24（6）：57-60.

［13］趙培欣，江珊.丹紅注射液對PCI術后患者ET-1、sP-sel及hs-CRP的影響［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2011，31（1）：11-14.

［14］金波，劉安東，李剛，等.丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注后損傷的保護作用及機制研究［J］.實用心腦肺血管病雜志，2009，17（1）：3-5.

［15］郭銳，趙高峰，封臻，等.丹紅注射液對急性腦梗死患者療效及血清MMP-9的影響［J］.中國實用神經疾病雜志，2010，13（24）：17-19.

EFFECTS OF DANHONG INJECTION ON ACTION AND NUMBER OF ENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS OF PATIENTS WITH DYSLIPIDEMIA

ZHONG Jie-xia

(Pharmacy Department of Jiangmen Peoples’s Hospital, Guangdong Jiangmen 529000, China)

Objective:To observe the effects of Danhong Injection on action and number of endothelial progenitor cells （EPCs） of patients with dyslipidemia. Methods: 160 dyslipidemia patients were randomly divided into treatment group and control group with 80 patients in each group. The patients in control group received conventional treatment；while the patients in treatment group were also received Danhong Injection on the basis of conventional treatment. After 10-day treatment， the EPCs in peripheral blood were obtained and cultured. Flow cytometry， inverted microscope， MTT assay and Boyden chamber were used to identify EPCs， and observe the adhesive ability， proliferation， migratory abilility，colony-formation ability and number of EPCs. Results: Danhong Injection could increase the adhesive ability， proliferation，migratory abilility， colony-formation ability and number of EPCs in peripheral blood of patients with dyslipidemia （P＜0.01，P＜0.05）. Conclusions: Danhong Injection may protect heart and cerebral vessels by improving actions of EPCs of patients with dyslipidemia.

Danhong Injection； Dyslipidemia； Endothelial progenitor cells （EPCs）

R285.5

A

1004-6879（2015）03-0183-04

2014-12-28）