呂逢春，趙紅玲

（承德醫(yī)學(xué)院，河北　承德　067000）

技術(shù)方法

高產(chǎn)谷胱甘肽菌種發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

呂逢春，趙紅玲Δ

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000）

GSH；四氧嘧啶法；菌種發(fā)酵

谷胱甘肽（GSH）化學(xué)名稱為γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物，GSH的結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)活潑的巰基-SH，易被氧化，這一特異結(jié)構(gòu)使其成為體內(nèi)主要的自由基清除劑，具有抗氧化、解毒等作用，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)藥、食品等行業(yè)。尤其在臨床上，GSH是一種治療肝病、腫瘤、中毒、白內(nèi)障等疾病以及抗衰老的重要生化藥物，市場需求量不斷增加。GSH的生產(chǎn)方法主要有萃取法、化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法，其中發(fā)酵法利用微生物自身代謝產(chǎn)生GSH，與其它方法相比具有簡便、易控、易擴(kuò)大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，從而成為主要的生產(chǎn)方法［1-2］。但目前我國GSH的發(fā)酵水平不高，因此，完善微生物發(fā)酵法生產(chǎn)工藝，提高發(fā)酵產(chǎn)量，成為工業(yè)化可行的前題［3］。

本研究在已知高產(chǎn)GSH菌種發(fā)酵的最佳時(shí)間在24-48h內(nèi)，通過進(jìn)一步優(yōu)化其發(fā)酵時(shí)間，確定最佳發(fā)酵時(shí)間段，以提高GSH的產(chǎn)量，為擴(kuò)大培養(yǎng)提供參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株：承德醫(yī)學(xué)院多肽實(shí)驗(yàn)室篩選高產(chǎn)菌株ZL136。

1.1.2化學(xué)試劑：GSH標(biāo)準(zhǔn)品、ALLOXAN（四氧嘧啶），Sigma公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉10、蛋白胨20、葡萄糖20、瓊脂20，pH值約為6；種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：L-Cys 6mmol/L，葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，MgSO40.6。

1.2方法

1.2.1測定方法：四氧嘧啶法（ALLOXAN試劑衍生化法）測定GSH含量［4-5］。

1.2.2培養(yǎng)方法：從斜面菌種上，用接種環(huán)挑菌至種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度30℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下，振蕩培養(yǎng)16h后，按照10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度30℃、轉(zhuǎn)速150rpm條件下，振蕩培養(yǎng)。

1.2.3取樣方法：按發(fā)酵時(shí)間從24-48h之間，每隔4小時(shí)取樣一次，每瓶取樣6ml菌液，其中3ml使用四氧嘧啶法測定GSH含量，另外3ml在105℃烘干至恒重，稱量計(jì)算得干菌重。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線采用四氧嘧啶Alloxan法測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），回歸方程為：y=0.1938x-0.0139，相關(guān)系數(shù)R2=0.9885。

圖1　GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2測定發(fā)酵液中GSH產(chǎn)量和菌體干重，并計(jì)算GSH產(chǎn)量在發(fā)酵時(shí)間24h-48h內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，GSH的產(chǎn)量也隨之增高，發(fā)酵時(shí)間為48h時(shí)，GSH產(chǎn)量達(dá)到最高，產(chǎn)量（平均值）為105.7mg/L。見表1、圖2：

表1　發(fā)酵時(shí)間對GSH產(chǎn)量的影響

圖2　發(fā)酵時(shí)間對GSH產(chǎn)量的影響

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對發(fā)酵時(shí)間的探索研究，最終確定了高產(chǎn)GSH菌株ZL136的最佳發(fā)酵時(shí)間為48h，產(chǎn)量（平均值）可達(dá)到105.7mg/L。本研究為擴(kuò)大培養(yǎng)提供了參考數(shù)據(jù)。

［1］王大慧，衛(wèi)功元.谷胱甘肽的應(yīng)用前景及生產(chǎn)研究現(xiàn)狀［J］.化學(xué)與生物工程，2004，（3）：10-12.

［2］周宇光，付國平，肖仔君.谷胱甘肽的生產(chǎn)和應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2003，24（3）：89-91.

［3］陳儉梅，周琳.幾種谷胱甘肽的檢測方法［J］.山東食品發(fā)酵， 2007，（3）：26-29.

［4］劉娟，王雅琴，劉剛，等.發(fā)酵液中還原型谷胱甘肽三種測定方法的改進(jìn)及其比較［J］.北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，31（3）：35-38.

［5］陶漢州.臨床生化檢驗(yàn)（上） ［M］.上海：上海科技出版社，1979.189

Q517

A

1004-6879（2015）05-0421-02

2014-12-15）