張琦釩 劉 成 李秉樞 方 桂 楊 青 洪 莉

武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢 430060

盆腔器官脫垂患者子宮旁韌帶組織中MMP-2、TIMP-2、TGF-β1的表達(dá)及相關(guān)性研究

張琦釩 劉 成 李秉樞 方 桂 楊 青 洪 莉

武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢 430060

目的探討盆腔器官脫垂（POP）患者子宮旁韌帶組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-2（TIMP-2）與轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的表達(dá)及關(guān)系。方法選取2014年7～10月武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的20例POPⅡ級及以上患者（POP組）和15例因婦科良性疾病行子宮全切術(shù)患者（對照組）的宮旁韌帶（骶韌帶、主韌帶）為試驗(yàn)材料，采用Western blot和實(shí)時熒光定量PCR檢測兩組組織中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)；比較兩組TGF-β1、MMP-2、TIMP-2的表達(dá)差異，并從蛋白水平分析POP組TGF-β1與MMP-2、TIMP-2表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果Western blot結(jié)果顯示POP組TGF-β1、TIMP-2表達(dá)均降低，MMP-2表達(dá)升高，且與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.432，P=0.019；u=0.000，P=0.02；u=0.000，P=0.003）；同樣的，實(shí)時熒光定量PCR中TGF-β1、TIMP-2表達(dá)降低，MMP-2表達(dá)上調(diào)，且與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.241，P=0.001；t=6.869，P=0.002；t=4.930，P=0.004）；相關(guān)性分析表明，TGF-β1與MMP-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.926，P=0.015），而與TIMP-2表達(dá)呈正相關(guān) （r=0.886，P=0.046）。結(jié)論P(yáng)OP患者宮旁韌帶中TGF-β1表達(dá)的降低可能是通過上調(diào)MMP-2、下調(diào)TIMP-2導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解增加，盆底支持組織彈性減弱，TGF-β1通路可以通過調(diào)節(jié)MMP-2和TIMP-2的平衡參與POP的發(fā)生。

盆腔器官脫垂；轉(zhuǎn)化生長因子β1；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-2

盆腔器官脫垂（pelvic organ prolapse，POP）是由于盆底支持組織松弛或損傷，引起盆腔臟器下垂，主要表現(xiàn)為陰道前、后壁膨出，陰道穹窿脫垂或子宮脫出，是中老年女性常見病。研究顯示，女性POP患者盆底支持組織中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分彈性蛋白及膠原蛋白合成與降解失衡導(dǎo)致支持組織彈性減弱，與POP發(fā)生密切相關(guān)[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族能夠降解大部分的ECM成分，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）是MMPs的天然特異性抑制物，能與相應(yīng)的MMPs特異性結(jié)合，抑制其活性。ECM代謝平衡依賴于MMPs和TIMPs之間的平衡，MMPs/TIMPs功能異?？赡茉斐膳璧捉M織降解增加[2]。彈性蛋白作為盆底支持組織ECM的主要成分是MMP-2主要的作用底物，TIMP-2是MMP-2的特異性組織抑制劑。目前POP患者主要是對MMP-9的研究，而MMP-2的研究較少。

轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一個多功能的生長因子，其主要的生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)ECM合成和降解，是組織纖維化信號級聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[3]。相關(guān)研究[4]證實(shí)POP患者恥骨宮頸筋膜組織中TGF-β1表達(dá)下降，TGF-β1通路參與了ECM的代謝和重構(gòu)，而MMP-2及TIMP-2作為ECM成分代謝的相關(guān)因子，其與TGF-β1的關(guān)系未有研究證實(shí)。本研究旨在通過檢測POP患者子宮旁韌帶組織中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2的表達(dá)，探討POP患者M(jìn)MP-2、TIMP-2表達(dá)與TGF-β1的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年7～10月武漢大學(xué)人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）婦產(chǎn)科收治的20例行子宮切除的POPⅡ級及以上患者納入試驗(yàn)組（POP組）；同時選擇在我院因非POP的良性婦科疾病行子宮切除手術(shù)的患者15例納入對照組，對照組包括宮頸上皮內(nèi)瘤變6例和子宮肌瘤9例。兩組患者均已婚，排除雌激素相關(guān)疾病，且3個月內(nèi)未進(jìn)行過激素治療。兩組的年齡、產(chǎn)次、體重指數(shù)等一般資料要求差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。見表1。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，簽訂知情同意書。

表1 兩組患者一般情況的比較（）

表1 兩組患者一般情況的比較（）

組別 年齡（歲） 產(chǎn)次（次） 體重指數(shù)（kg/m2）POP組（n=20）對照組（n=15）t值P值58.80±3.93 56.69±2.87 1.598 0.122 2.40±0.99 2.31±1.11 0.233 0.817 25.11±1.53 24.71±1.86 0.623 0.539

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑 BAC試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、PMSF和RIPA組織裂解液（中國武漢谷歌生物有限公司）、Trizol（Invitrogen，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），SYBRPremixExTaqSystem（Takara，日本），PCR引物合成 （上海生工生物工程有限公司），TGF-β1一抗（Santa Cruz，美國），MMP-2一抗（Santa Cruz，美國），TIMP-2一抗（Santa Cruz，美國），GAPDH一抗（Santa Cruz，美國），熒光二抗（LI-COR，美國）。

1.2.2 取材 對照組和POP組分別于手術(shù)中取患者被切除子宮的宮旁韌帶兩塊，大小約0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm，放入-80℃超低溫冰箱保存，待Western blot和實(shí)時熒光定量PCR（Real Time-PCR）檢測。

1.2.3 Western blot檢測法 取組織稱重后經(jīng)液氮粉碎，加入RIPA組織裂解液，冰上進(jìn)行勻漿，裂解反應(yīng)30 min，12 000×g、4℃離心5 min，上清分裝置于-80℃?zhèn)溆茫珺CA法檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后煮沸。30 μg樣本上樣，進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育TGF-β1（1∶1000）、MMP-2（1∶200）、TIMP-2（1∶500）一抗過夜，TBST清洗3次（每次10 min），1∶10 000稀釋的熒光二抗避光搖動1 h，TBST清洗3次（每次10 min），使用 Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描成像。GAPDH（1∶1000）作為內(nèi)參。

1.2.4 Real Time-PCR檢測法 采用Trizol法提取組織總RNA，將6 μL的總RNA加入20 μL的反應(yīng)體系中，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。在美國Applied Biosystems公司7300/7500實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行Real Time-PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系為20 μL。擴(kuò)增條件為：95℃30 s→95℃5 s→60℃34 s→95℃15 s→60℃1 min→95℃15 s→60℃15 s，共40個循環(huán)。所用引物序列為TGF-β1正義鏈：5'-TATTGAGCACCTTGGGCACT-3'，反義鏈：5'-ACCTCTCTGGGCTTGTTTCC-3'；MMP-2正義鏈：5'-AGTTTCCATTCCGCTTCCAG-3'，反義鏈：5'-CGGTCGTAGTCCTCAGTGGT-3'；TIMP-2正義鏈5'-TCTGGAAACGACATTTATGG-3'，反義鏈：5'-GTTGGAGGCCTGCTTATGGG-3'。β-actin作為內(nèi)參，其引物序列正義鏈：5'-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3'，反義鏈：5'-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3'。2-ΔΔCt法表示相對定量結(jié)果，根據(jù)公式ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因、ΔΔCt=Ct試驗(yàn)組-Ct對照組計(jì)算，2-ΔΔCt表示POP組目標(biāo)基因相對于對照組原始拷貝數(shù)的倍數(shù)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對兩組各項(xiàng)數(shù)據(jù)行K-S檢驗(yàn)確定其正態(tài)性，組間均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊性。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)驗(yàn)證均呈正態(tài)分布，若數(shù)據(jù)方差齊進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則行獨(dú)立樣本Mann-Whitney U檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測兩組患者TGF-β1、MMP-2、TIMP-2的蛋白表達(dá)

對照組TGF-β1平均灰度值為0.896±0.164，POP組為0.484±0.110，TGF-β1表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.432，P=0.019）；對照組MMP-2表達(dá)為0.566± 0.101，POP組為1.005±0.241，MMP-2表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（u=0.000，P=0.003）；TIMP-2平均灰度值對照組為1.038±0.127，POP組為0.603±0.051，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（u=0.000，P=0.02）。見圖1。

2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測兩組TGF-β1、MMP-2、TIMP-2 mRNA表達(dá)

圖1 Western blot檢測兩組TGF-β1、MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)

與蛋白表達(dá)結(jié)果類似，POP患者TGF-β1mRNA表達(dá)為對照組0.802倍，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.241，P=0.001）；POP組TIMP-2 mRNA表達(dá)為對照組0.526倍，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.869，P=0.002）；MMP-2表達(dá)上調(diào)，為對照組1.749倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.930，P=0.004）。見圖2。

圖2 實(shí)時熒光定量PCR檢測兩組TGF-β1、MMP-2、TIMP-2 mRNA表達(dá)（**P＜0.01）

2.3 POP組子宮旁韌帶組織中TGF-β1在蛋白水平與MMP-2、TIMP-2的相關(guān)性

在蛋白水平，相關(guān)性分析TGF-β1與MMP-2呈負(fù)相關(guān)（r=-0.926，P=0.015）；TGF-β1與TIMP-2呈正相關(guān)（r=0.886，P=0.046）。

3 討論

POP是中老年婦女的常見疾病，主要病理表現(xiàn)為盆底支持組織結(jié)構(gòu)和功能完整性被破壞，其雖為非致死性疾病，但給患者日常生活和工作帶來了極大的影響和精神上的壓力，也給社會經(jīng)濟(jì)造成負(fù)擔(dān)[5]。ECM是由細(xì)胞合成后分泌到胞外并分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子物質(zhì)，包括膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖、層粘連蛋白和纖連蛋白等成分，盆底支持組織ECM以彈性蛋白和膠原蛋白為主。研究認(rèn)為彈性蛋白和膠原含量減少，各型膠原比例改變，膠原之間交聯(lián)減少與POP發(fā)病有關(guān)[6-8]。Chen等[9]和Kushner等[10]的研究表明盆底筋膜組織中膠原含量的減少不是因?yàn)榕璧壮衫w維細(xì)胞合成和分泌膠原蛋白減少，而是因?yàn)槟z原降解增加。因此，POP的發(fā)生與盆底組織中ECM重構(gòu)有關(guān)，膠原、彈性蛋白成分脫失是重要的病理機(jī)制。

MMPs是一類高度保守的依賴鋅離子和鈣離子的內(nèi)切水解酶家族，能夠降解ECM蛋白和細(xì)胞周圍微環(huán)境，包括膠原蛋白、非膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖、層粘連蛋白和纖連蛋白等[11-12]。TIMPs為MMPs的特異性抑制因子，與活化的MMPs以1∶1的比例以非共價鍵不可逆結(jié)合形成復(fù)合物，抑制MMPs的活性[13]。MMPs與TIMPs協(xié)同表達(dá)，平衡ECM的代謝，二者的平衡在組織重建、創(chuàng)傷修復(fù)、血管新生等多種病理和生理過程中起作用[12]。Dviri等[14]在POP患者的陰道前壁和骶韌帶組織中發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的MMP-1和MMP-9，但目前關(guān)于POP患者M(jìn)MP-2和TIMP-2的研究較少。MMP-2又稱為明膠酶A，主要由結(jié)締組織細(xì)胞以非活性酶原形式分泌[15]，其主要作用底物是彈性蛋白、纖連蛋白和Ⅳ型膠原，特異性組織抑制劑為TIMP-2。MMP-2活化由膜型基質(zhì)降解酶（MT-MMP）啟動，首先MMP-2結(jié)合到MT-MMP/TIMP-2復(fù)合物上形成MT-MMP/TIMP-2/MMP-2酶原復(fù)合物，然后鄰近的游離MT-MMP分解已固定的MMP-2酶原，而后自發(fā)水解釋放出活性的MMP-2[16]。因此可以用TIMP-2的表達(dá)反映MMP-2活性受抑制的程度，當(dāng)TIMP-2過量時可減少細(xì)胞內(nèi)游離MT-MMP含量，使MMP-2酶原無法活化，反之，TIMP-2量少時，MMP-2酶原活化增加。本研究從蛋白水平發(fā)現(xiàn)POP患者宮旁韌帶組織中MMP-2表達(dá)增加，而TIMP-2表達(dá)下降，且與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明MMP-2表達(dá)增強(qiáng)，加之TIMP-2減少使MMP-2活性增加，ECM降解多于合成，促進(jìn)ECM的缺失。在轉(zhuǎn)錄水平，熒光定量PCR結(jié)果與Western blot類似，MMP-2表達(dá)增加，而TIMP-2表達(dá)下降。

TGF-β1作為重要的促纖維化因子可以調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程、促進(jìn)纖維母細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化、導(dǎo)致蛋白水解酶的產(chǎn)生[17-18]、增加膠原蛋白的合成、刺激細(xì)胞及ECMⅠ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增加[19]；并且可以通過調(diào)節(jié)MMPs的產(chǎn)生和活性來調(diào)節(jié)ECM的代謝[20]。Seeland等[21]通過在小鼠中過表達(dá)TGF-β1引起心肌纖維化，檢測出TIMP-2的高表達(dá)。本試驗(yàn)研究顯示與正常組相比，POP組子宮旁韌帶中TGF-β1在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平mRNA中都有顯著下調(diào)，與符愛珍等[22]的研究結(jié)果類似。相關(guān)性分析顯示TGF-β1與MMP-2呈負(fù)相關(guān)（r=-0.926，P=0.015）；TGF-β1與TIMP-2呈正相關(guān)（r=0.886，P=0.046），說明POP患者宮旁韌帶中TGF-β1表達(dá)的降低激活了MMP-2和TIMP-2，使MMP-2/TIMP-2平衡被打破，導(dǎo)致ECM降解增加，盆底支持組織彈性減弱。TGF-β1通路可以通過調(diào)節(jié)MMP-2和TIMP-2的平衡參與POP的發(fā)生。

TGF-β1信號對MMP-2和TIMP-2的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，TGF-β1表達(dá)降低后可以通過各種不同的下游事件來完成對它們的激活，如TGF-β1可以在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)α2巨球蛋白的表達(dá)，MMPs與其結(jié)合后功能受抑制[23]，并且TGF-β1可以抑制纖溶酶原激活劑活性，使其抑制劑產(chǎn)生增多，抑制MMPs的生成，增加TIMPs的產(chǎn)生[24-25]，也可通過調(diào)節(jié)Smad通路[25]、Ras/ERK途徑、MAPK通路等，但具體機(jī)制尚不清楚。

隨著國內(nèi)外對POP發(fā)病機(jī)制的深入研究，ECM重構(gòu)與盆底的關(guān)系越來越受到關(guān)注，而TGF-β1通路作為調(diào)節(jié)組織纖維化的重要細(xì)胞因子也是研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示POP患者宮旁韌帶中TGF-β1表達(dá)下降使MMP-2/TIMP-2平衡被打破，上調(diào)的MMP-2和下調(diào)的TIMP-2使ECM降解增加，TGF-β1信號通路可以通過調(diào)節(jié)MMP-2和TIMP-2的平衡參與POP的發(fā)生。臨床上或許可以通過干預(yù)TGF-β1通路來延緩POP的發(fā)生，但是POP患者宮旁韌帶中TGF-β1表達(dá)降低及其對MMP-2和TIMP-2調(diào)控的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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ExPression of MMP-2 and TIMP-2 in Parametrial ligaments and their relationshiPs with TGF-β1of Patients with Pelvic organ ProlaPsed

ZHANG Qifan LIU Cheng LI Bingshu FANG Gui YANG Qing HONG Li
Department of Gynaecology and Obstetrics,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060, China

Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and tissue inhibitors of metalloproteinase-2 (TIMP-2)in parametrial ligaments and their relationships with transforming growth factor-β1(TGF-β1)of patients with pelvic organ prolapsed(POP).Methods A cohort of 20 POP patients(POP group)and 15 patients who received hysterectomy for benign gynecological diseases (control group,6 patients of cervical intraepithelial neoplasia and 9 patients of uterine fibroid)was accrued from July to October 2014 at Renmin Hospital of Wuhan University.The expressions of TGF-β1,MMP-2 and TIMP-2 in parametrial ligaments were examined by Western Blot and Real-time Quantitative PCR respectively.The differences of expression in the two groups and correlational analyses were conducted between TGF-β1and MMP-2 as well as TIMP-2.Results It was a significantly lower expression of TGF-β1 and TIMP-2 (t=3.432,P=0.019;u=0.000,P=0.02),but higher expressions of MMP-2(u=0.000,P=0.003)at protein level as well as at mRNA level (t=8.241,P= 0.001;t=6.869,P=0.002;t=4.930,P=0.004)in parametrial ligaments from POP group compared to controls. Correlation analysis showed that TGF-β1and TIMP-2 were positively correlated (r=0.886,P=0.046),while TGF-β1and MMP-2 were negatively correlated(r=-0.926,P=0.015).Conclusion The expression of TGF-β1is lower in parametrial ligaments from patients with POP that may up-regulate the expression of MMP-2 and down-regulate the expression of TIMP-2,resulting in the increased degradation extracellular matrix(ECM)and then relaxation of pelvic support tissue.TGF-β1pathway can concerned in pathophysiology of POP by adjusting the balance of MMP-2 and TIPM-2.

Pelvic organ prolapsed;Transforming growth factor-β1;Matrix metalloproteinase-2;Tissue inhibitors of metalloproteinase-2

R711.5

A

1673-7210（2015）11（a）-0077-05

2015-04-13本文編輯：關(guān) 婧）

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81270684）。

張琦釩（1993-），女，武漢大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)學(xué)2009級七年制在讀，主要從事盆底功能障礙性疾病和婦科腫瘤的研究。

洪莉（1970-），女，博士，教授，武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦二科主任，主要從事盆底功能障礙性疾病和婦科腫瘤的研究。