李元林 吳 群 陳 瑤 彭凱麗 雷小勇

1.湖南省婁底市中心醫(yī)院藥劑科，湖南婁底 417000；2.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南衡陽 421001

桑菊口服液抗菌活性成分研究

李元林1吳 群1陳 瑤1彭凱麗1雷小勇2

1.湖南省婁底市中心醫(yī)院藥劑科，湖南婁底 417000；2.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南衡陽 421001

目的 對桑菊口服液抗菌活性成分進(jìn)行研究。方法采用反相硅膠柱層析分離技術(shù)對桑菊口服液進(jìn)行有效部位的分離，在體外抗菌活性篩選結(jié)果的指導(dǎo)下利用現(xiàn)代色譜分離方法（硅膠柱色譜、羥丙基葡聚糖凝膠色譜以及制備液相等）分離有效部位各成分化合物，通過理化常數(shù)測定和光譜分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果從桑菊口服液抗菌活性部位分離鑒定了9個(gè)酚酸類化學(xué)成分：3-（3-羥基-苯基）-丙酸、3-（3-羥基-苯基）-丙酸甲酯、肉桂酸、3-羥基-1-（3-甲氧基-4-羥基苯）丙烷-1、3-羥基-1-（3，5-二甲氧基-4-羥基苯）丙烷-1、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草酸、沒食子酸。結(jié)論桑菊口服液的抗菌作用源于酚酸類化學(xué)成分的作用，且化合物1～9為首次從桑菊口服液中分離得到。

桑菊口服液；抗菌作用；藥效學(xué)；活性成分

復(fù)方桑菊處方源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，由桑葉、野菊花、連翹、甘草等8味藥材組成，臨床上多用于風(fēng)熱感冒、上呼吸道感染、流行性結(jié)膜炎、麻疹、流感等外感熱病初起、邪氣輕淺發(fā)熱不重者[1-5]。以桑菊飲為主制成的多種中藥制劑廣泛用于臨床，目前文獻(xiàn)報(bào)道的桑菊處方的劑型有湯劑、散劑、丸劑、片劑等，該復(fù)方組方療效確切，目前對桑菊復(fù)方的研究僅限于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和劑型，尚未見其藥效學(xué)評價(jià)和復(fù)方活性物質(zhì)的基礎(chǔ)研究。桑菊清熱口服液為湖南省婁底市中心醫(yī)院在醫(yī)院制劑桑菊合劑基礎(chǔ)上研制的新制劑[6-7]，本研究采用現(xiàn)代分離純化技術(shù)對篩選出來抗菌部位活性成分進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究。為其臨床應(yīng)用和桑菊復(fù)方的二次開發(fā)提供藥效學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌（批號：26112-5），肺炎鏈球菌（批號：31001），白色念珠菌（批號：9800）均購自中國藥品生物制品檢定所；Muller-Hinton（MH）液體培養(yǎng)基（杭州微生物試劑廠，批號：20110612），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州微生物公司，批號：20110416-03），水解酪蛋白（M-H）瓊脂（杭州微生物公司，批號：20110305-00）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方桑菊清熱口服液（醫(yī)院自制，批號：20110601，規(guī)格：1 mL/支，其中綠原酸和連翹苷的含量標(biāo)準(zhǔn)為每1 mL含量分別不低于0.06 mg和0.10 mg），HP-101大孔樹脂（日本三菱化學(xué)株式會(huì)社），羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）（TOYOPEARL TOSOH，日本），聚酰胺樹脂（國藥集團(tuán)，80～100目，100～200目），硅膠GF254（青島海洋化工廠）。

1.3 儀器

Agilent 1200/1100series分析型高效液相（二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司），UV-2540紫外-可見分光光度計(jì)（島津香港有限公司），DJ-1002電子天平（江蘇常熟市意歐儀器儀表有限公司），數(shù)字式電子體溫計(jì)（東莞市黃江百綠電子廠），DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），YXQ-LS-50型高壓滅菌器（上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

2 方法

2.1 復(fù)方桑菊口服液的制備

按處方量取桑葉400 g、野菊花160 g、連翹215 g、苦杏仁120 g、桔梗235 g、甘草220 g、蘆根220 g、薄荷葉30 g共8味藥材加8倍水量、浸泡2 h后，加熱保持煮沸1 h，分離煎出液，藥渣再加6倍量水煮沸0.5 h，過濾，濾液低溫濃縮至一定量，加入單糖漿50 mL，再濃縮至1000 mL，加入1%殼聚糖，靜置12 h，離心，吸取上清液，加入防腐劑，分裝1 mL/支，即得。

2.2 復(fù)方桑菊有效部位抗菌活性篩選試驗(yàn)和成分分離

復(fù)方桑菊口服液過反相硅膠柱，用H2O，30%乙醇，50%乙醇沖洗，分離得到A、B、C三個(gè)部位，將3個(gè)部位濃縮后，配制成濃度為0.5、0.25、0.125、0.063、0.032、0.016 mg/mL藥物，將不同濃度的藥物A、B、C肉膏瓊脂平板培養(yǎng)基上，分別接種肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌，放入37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h取出，觀察不同細(xì)菌在不同濃度的藥物平板上的生長情況，測量出藥物對細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）[8-11]。抗菌活性部位用30%MeOH溶解上Sephadex LH-20柱[12]，H2O-MeOH梯度洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20柱反復(fù)純化后，制備液相分離得到化合物單體，并通過運(yùn)用理化性質(zhì)和光譜技術(shù)（UV、IR、1H NMR、13C NMR等）鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 抗菌活性部位篩選結(jié)果

復(fù)方桑菊有效部位抗菌活性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方桑菊口服液的B部分，即反相硅膠柱的30%乙醇部位，對肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌菌具有強(qiáng)的抑菌活性，其MIC分別為0.016、0.016、0.016 mL/mL。見表1。

表1 不同項(xiàng)目桑菊口服液MIC比較（mL/mL）

3.2 復(fù)方桑菊有效部位抗菌活性成分分離結(jié)果

從復(fù)方桑菊30%部分分離得到化合物單體結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 化合物結(jié)構(gòu)圖

3.2.1 化合物1∶3-（3-羥基-苯基）-丙酸 白色針晶，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6，TMS），δ：2.49（2H，t，J= 8.0，7.6 Hz，H-2），2.73（2H，t，J=8.0，7.6 Hz，H-3），6.61（3H，m，H-2'，4'，6'），7.05（1H，t，J=7.6 Hz，H-5'），12.09（1H，s，1-COOH），9.25（1H，s，3'-OH）；13CNMR（100 MHZ，DMSO-d6），δ：171.4（C-1），35.5（C-2），30.6（C-3），142.6（C-1'），115.4（C-2'），157.6（C-3'），113.2（C-4'），129.6（C-5'），119.1（C-6'）。綜合分析1H NMR、13C NMR譜圖，并與文獻(xiàn)[13]對照確定化合物1為3-（3-羥基-苯基）-丙酸。

3.2.2 化合物2∶3-（3-羥基-苯基）-丙酸甲酯 白色針晶，1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6，TMS），δ：2.58（2H，t，J=8.0，7.6 Hz，H-2），2.76（2H，t，J=8.0，7.6 Hz，H-3），6.61（3H，m，H-2'，4'，6'），7.05（H，t，J=7.6 Hz，H-5'），9.30（1H，s，3'-OH），3.58（3H，s，1-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6），δ：173.0（C-1），35.1（C-2），30.5（C-3），142.2（C-1'），115.4（C-2'），157.7（C-3'），113.4（C-4'），129.6（C-5'），119.1（C-6'），51.6（-OCH3）。綜合分析1H NMR和13C NMR譜圖，與文獻(xiàn)[13]對照確定化合物2為3-（3-羥基-苯基）-丙酸甲酯。

3.2.3 化合物3∶肉桂酸 白色針晶，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6，TMS），δ：7.68（2H，m，H-2，6），7.42（3H，m，H-3，4，5），7.60（H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.54（H，d，J= 16.0 Hz，H-8），12.46（1H，s，-COOH）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6），δ：130.5（C-1），128.5（C-2），129.2（C-3），119.5（C-4），129.2（C-5），128.5（C-6），134.5（C-7），144.2（C-8），167.8（C-9）。綜合分析1H NMR和13C NMR譜圖，并與文獻(xiàn)[14]對照確定化合物3為肉桂酸。

3.2.4 化合物4∶3-羥基-1-（3-甲氧基-4-羥基苯）丙烷-1 白色針晶，1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6，TMS），δ：3.05（2H，t，J=6.5，6.5 Hz，H-2），3.75（2H，t，J=6.5，6.5 Hz，H-3），7.44（H，t，J=2.0 Hz，H-2'），6.86（H，t，J=8.0 Hz，H-5'），7.51（H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6'），4.57（1H，s，3-OH），9.97（1H，s，4'-OH），3.82（3H，3'-OCH3）；13C-NMR （125 MHz，DMSO-d6），δ：197.5（C-1），41.2（C-2），57.5（C-3），119.2（C-1'），115.2（C-2'），151.9（C-3'），147.8（C-4'），111.4（C-5'），123.4（C-6'），55.8（3'-OCH3）。綜合分析1H NMR和13C NMR譜圖，并與文獻(xiàn)[15]對照確定化合物4為3-羥基-1-（3-甲氧基-4-羥基苯）丙烷-1。

3.2.5 化合物5∶3-羥基-1-（3，5-二甲氧基-4-羥基苯）丙烷-1白色粉末，1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6，TMS），δ：3.10（2H，t，J=6.5，6.5 Hz，H-2），3.76（2H，t，J=6.0，6.0 Hz，H-3），7.24（H，s，H-2'，6'），9.34（1H，s，4'-OH），3.82（6H，3'，5'-OCH3）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6），δ：197.3（C-1），41.2（C-2），57.3（C-3），127.6（C-1'），106.3（C-2'），147.8（C-3'），141.1（C-4'），147.8（C-5'），106.3（C-6'），57.4（3'-OCH3），57.5（5'-OCH3）。綜合分析1H NMR和13C NMR譜圖，并與文獻(xiàn)[15]對照確定化合物5為3-羥基-1-（3，5-二甲氧基-4-羥基苯）丙烷-1。

3.2.6 化合物6∶對羥基苯甲酸 無色棱形結(jié)晶，UV λmax（MeOH）nm：285，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6，TMS），δ12.45（1H，s，1-COOH），6.81（1H，d，J=8.4 Hz，2-H），7.78（1H，d，J=8.4 Hz，3-H），10.24（1H，s，4-OH），7.78（1H，d，J=8.4 Hz，5-H），6.81（1H，d，J=8.4 Hz，6-H）。綜合分析1H NMR譜圖，確定化合物6為對羥基苯甲酸。

3.2.7 化合物7∶原兒茶酸 白色粉末，UV λmax（MeOH）nm：258，304，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6，TMS），δ12.30（1H，s，1-COOH），9.34（1H，d，J=1.6 Hz，2-H），9.27（1H，s，3-OH），9.65（1H，s，4-OH），6.78（1H，d，J=8.0 Hz，5-H），7.29（1H，dd，J=8.4，1.6 Hz，6-H）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3），δ（ppm）：122.3（C-1），116.8（C-2），145.2（C-3），150.3（C-4），115.5（C-5），121.9（C-6），167.7（1-COOH）。綜合分析1H NMR和13C NMR譜圖，確定化合物7為原兒茶酸。

3.2.8 化合物8∶香草酸 白色粉末，UV λmax（MeOH）nm：278，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6，TMS），δ12.30（1H，s，1-COOH），7.46（1H，d，J=1.6 Hz，2-H），3.81（1H，s，3-OCH3），9.87（1H，s，4-OH），6.84（1H，d，J=8.0 Hz，5-H），7.43（1H，dd，J=8.4，1.6 Hz，6-H）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3），δ（ppm）：123.8（C-1），115.3（C-2），151.4（C-3），147.5（C-4），113.0（C-5），121.9（C-6），167.5（1-COOH），55.8（3-OCH3）。綜合分析1H NMR和13C NMR譜圖，確定化合物8為香草酸。

3.2.9 化合物9∶沒食子酸 白色粉末，UV λmax（MeOH）nm：258，304，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6，TMS），δ9.21（1H，s，1-OH），8.85（1H，s，2-OH），9.21 （1H，s，3-OH），6.92（1H，s，4-H），12.25（1H，s，5-COOH），6.92（1H，s，6-H）；13C-NMR （DMSO-d6，100 MHz），δ（ppm）：145.7（C-1），138.3（C-2），145.7（C-3），109.0（C-4），120.7（C-5），109.0（C-6），167.8（5-COOH）。綜合分析1H NMR譜和13C NMR譜圖，確定化合物9為沒食子酸。

4 小結(jié)

中藥復(fù)方具有多向性、多層面、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，使細(xì)菌難以同時(shí)產(chǎn)生對抗多種抗菌成分的多重突變，中藥復(fù)方在抗感染方面的研究也有很大的成效，復(fù)方中的單味藥在臨床上的應(yīng)用已越來越廣泛。據(jù)報(bào)道桑葉和野菊花單味藥材具有抗菌和抗病毒的作用[16-18]，在一定程度上驗(yàn)證了君藥和臣藥在中藥復(fù)方中的作用和地位。與文獻(xiàn)比較桑菊口服液的MIC小于桑葉和野菊花單味藥材的MIC，體現(xiàn)出桑菊復(fù)方中藥相比單味藥材在藥效學(xué)上的優(yōu)勢。

本研究首次采用藥理活性追蹤的化學(xué)分離方法，即體外抗菌活性篩選指導(dǎo)對桑菊口服液抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，復(fù)方桑菊口服液過反相硅膠柱的30%乙醇部位為桑菊口服液抗菌活性的有效部位，并從抗菌活性部位分離出9個(gè)酚酸類成分：3-（3-羥基-苯基）-丙酸、3-（3-羥基-苯基）-丙酸甲酯、肉桂酸、3-羥基-1-（3-甲氧基-4-羥基苯）丙烷-1、3-羥基-1-（3，5-二甲氧基-4-羥基苯）丙烷-1、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草酸、沒食子酸，這些酚酸類化合物是其抗菌的有效成分[19-22]，初步驗(yàn)證了采用“生物活性導(dǎo)向”的實(shí)驗(yàn)方法作為研究中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)的可行性，本研究為進(jìn)一步開發(fā)桑菊復(fù)方中藥提供了重要依據(jù)。

[1]吳曉慧.桑菊飲加減治療上呼吸道感染40例[J].陜西中醫(yī)，2009，30（4）：401-402.

[2]張保國，梁曉夏，劉慶芳，等.桑菊飲藥效學(xué)研究及其現(xiàn)代臨床應(yīng)用[J].中成藥，2007，29（12）：1813-1816.

[3]Crystal LL，Susan LB，Amy LV，et al.Influenza virus coinfection with Bordetella bronchiseptiea erlhFlCeSbacterial colonization and host responses exacerbating pulmonary lesions[J].Microbial Pathogenesia，2011，49（5）：237-245.

[4]王淑梅，李凌霞，呂增祿.中藥治療風(fēng)熱感冒的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015，21（6）：1075-1077.

[5]蔡燕，邢艷，謝文光.中藥抗菌作用研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8（6）：9-10.

[6]李元林，吳群，彭凱麗，等.RP-HPLC法測定復(fù)方桑菊清熱口服液中綠原酸、蒙花苷、連翹苷的含量[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，10（3）：90-93.

[7]彭凱麗，李新民，李元林，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選復(fù)方桑菊口服液中藥材的提取工藝[J].中國藥房，2014，25（3）：243-245.

[8]甘秀海，梁志遠(yuǎn)，姜金仲.冷水花抗菌活性成分研究[J].中國中藥雜志，2014，49（23）：2069-2072.

[9]王榮.不同炮制方法對黃連主成份含量及抗菌活性的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（1）：58-60.

[10]馬明坤，閆衛(wèi)利，魏葆琳，等.清熱合劑對上呼吸感染常見致病菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].天津醫(yī)藥，2015，43（1）：38-41.

[11]曾雪花，周桂保.黃連解毒湯體外抗菌活性研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（19）：161-162.

[12]黃依玲，馮潔，賴茂祥.兩面針葉抗菌活性部位研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（21）：13-16.

[13]Marumoto S，Miyazawa M.Microbial reduction of coumarin，psoralen，and xanthyletin by Glomerella cingilata[J].Tetrahedron.2011，67（2）：495-500.

[14]Chimichi S，De Sio F，Donati D，et al.The preparation of coumaric acids via styrylisoxazoles[J].Heterocycle，1983，20（19）：263-267.

[15]Lin RC，Skaltsounis A，Seguin E，et al.Phenolic constituents of Selaginella doederleinii[J].Planta Medica，1994，60（2）：168-170.

[16]宋雷，綻春蕊，楊世英，等.杭黃菊提取物的體外抗菌活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（7）：455-458.

[17]陳凱，屈亞楠.野菊花活性成分及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].安徽化工，2014，40（1）：10-13.

[18]姚帆，徐惠波.中藥野菊花抗菌抗病毒作用研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（2）：298-299.

[19]范芳，鄧偉杏.肉桂酸丙酯抑菌活性的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（11）：158-160.

[20]李高申，張偉，彭濤，等.冬凌草抗菌活性成分研究[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（3）：610-613.

[21]吳文華，張曉雷，韓鳳梅.原兒茶酸與拉米夫定體外聯(lián)合抗HBV藥效學(xué)研究[J].湖北大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（2）：193-195.

[22]張鯤，李巖，張卓然，等.中藥化學(xué)成分抗菌活性化學(xué)信息學(xué)研究[J].中國中藥雜志，2013，38（5）：777-779.

Study on antibacterial constituents of Sangju oral liquid

LI Yuanlin1WU Qun1CHEN Yao1PENG Kaili1LEI Xiaoyong2

1.Department of Pharmacy,Loudi Municipal Central Hospital of Hu'nan Province,Loudi417000,China;2.Institute of Pharmaceutical and Pharmacology,University of South China,Hu'nan Province,Hengyang 421001,China

Objective To study antibacterial constituents of Sangju Oral Liquid.Methods The effective parts of Sangju Oral Liquid were isolated by reversal phase silica gelcolumn chromatography,under the guidance of the screening antibacterial activity results in vitro,the compounds of Sangju Oral Liquid effective parts were isolated by modern chromatographic separation (silica gelcolumn chromatography,sephhadex LH-20,Prep-HPLC and so on).On the basis of spectroscopic methods and physicochemical properties,the structures of these compounds were elucidated.Results Nine constituents were isolated and elucidated from antibacterial active site of Sangju Oral Liquid,the structures of 9 compounds were:3-（3-hydroxyl-phenyl）-propionate,3-（3-hydroxyl-phenyl）-methoxypropionate,cinnamic acid,3-hydroxy-1-（3-methoxy-4-Hydroxy phenyl）propan-1-one,3-hydroxy-1-（3，5-dimethoxy-4-Hydroxyphenyl）propan-1-one,p-hydroxybenzoic acid,protocatechuic acid,vanilloid,gallic acid.Conclusion The antibacterial activity of Sangju Oral Liquid stems from phenolicacid constituents,and compounds 1-9 are the first time isolated from Sangju Oral Liquid.

Sangju Oral Liquid;Antibacterial action;Pharmacodynamics;Antibacterial constituents

R914.1

A

1673-7210（2015）11（a）-0057-04

2015-06-01本文編輯：趙魯楓）

李元林（1982.9-），女，碩士研究生，主要從事冠心病介入治療。

雷小勇（1970.3-），男，教授，主要從事藥理學(xué)與臨床藥學(xué)研究。