石 峰 李冬梅 楊銳睿 蘇玉靜 費(fèi)秀靜

1.河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院耳鼻喉科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市開灤職業(yè)病防治院耳鼻喉科，河北唐山 063301；3.河北省唐山市開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北唐山 063100；4.河北省唐山市開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院手術(shù)室，河北唐山 063100；5.河北省唐山市開灤總醫(yī)院趙各莊醫(yī)院外科，河北唐山 063100

內(nèi)皮祖細(xì)胞在噪聲性耳聾耳蝸損傷中的變化

石 峰1李冬梅2楊銳睿3蘇玉靜4費(fèi)秀靜5

1.河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院耳鼻喉科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市開灤職業(yè)病防治院耳鼻喉科，河北唐山 063301；3.河北省唐山市開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北唐山 063100；4.河北省唐山市開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院手術(shù)室，河北唐山 063100；5.河北省唐山市開灤總醫(yī)院趙各莊醫(yī)院外科，河北唐山 063100

目的探討內(nèi)皮祖細(xì)胞在噪聲性耳聾耳蝸損傷中的變化。方法50只SD大鼠分為兩組，其中空白對照組10只，實(shí)驗(yàn)組40只?？瞻讓φ战M不做處理，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行噪聲暴露構(gòu)建噪聲性耳聾動物模型，并按照暴露時間分為4組，分別為暴露后即刻組和暴露后1 d組、暴露后7 d組、暴露后14 d組，每組各10只。分別檢測各組動物的外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞水平和血管內(nèi)皮生長因子、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及CD34水平，并進(jìn)行比較。結(jié)果暴露后即刻組和暴露后1 d組、暴露后7 d組的外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞水平均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但暴露后14 d組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。暴露后1 d組、暴露后7 d組的血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但暴露后即刻組、暴露后14 d組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露后即刻、暴露后l d的CD34均呈微弱表達(dá)，噪聲暴露后7 d呈強(qiáng)表達(dá)；噪聲暴露后14 d呈陽性表達(dá)；噪聲暴露后即刻的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶呈微弱表達(dá)，暴露后1 d呈強(qiáng)表達(dá)，暴露后7、14 d組呈陽性表達(dá)。經(jīng)掃描電鏡結(jié)果顯示：空白對照組動物的內(nèi)耳內(nèi)外毛細(xì)胞均呈現(xiàn)出整齊排列的情況，暴露后即刻組、暴露后1 d組可見內(nèi)耳毛細(xì)胞呈現(xiàn)出紊亂狀態(tài)，暴露后7 d組、暴露后14 d組，經(jīng)觀察動物耳蝸第二圈可見外毛細(xì)胞呈現(xiàn)出紊亂、缺失等現(xiàn)象。結(jié)論噪聲性耳聾會導(dǎo)致耳蝸損傷的出現(xiàn)，內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量會隨著時間的變化發(fā)生改變，并在耳蝸損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

噪聲性耳聾；耳蝸損傷；內(nèi)皮祖細(xì)胞；變化

現(xiàn)如今，噪聲已經(jīng)成為一大污染因素，它不但會影響人們的情緒波動甚至?xí)θ梭w健康造成嚴(yán)重的危害，很多耳鳴耳聾患者屬于噪聲性耳聾[1]。噪聲性耳聾會對患者的耳蝸造成不同程度的損傷，導(dǎo)致耳蝸微血管出現(xiàn)收縮，并進(jìn)一步導(dǎo)致耳蝸缺血和缺氧等情況的出現(xiàn)[2-3]。隨著血管內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)理論和研究的深入，內(nèi)皮祖細(xì)胞與耳蝸損傷及在內(nèi)皮化相關(guān)問題受到關(guān)注，并為臨床噪聲性耳聾的治療等提供了新思路。本研究通過構(gòu)建動物模型的方式，探討內(nèi)皮祖細(xì)胞在噪聲性耳聾耳蝸損傷中的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

50只SD大鼠，由南京君科生物工程有限公司提供，雌雄各半，體重16～20 g，年齡7 d。本研究相關(guān)內(nèi)容和方法均經(jīng)醫(yī)院倫理部門審核并批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案、使用動物品種品系規(guī)格、處死動物的方法、項(xiàng)目進(jìn)行中設(shè)計(jì)動物福利和倫理問題等均符合要求。

1.2 試劑與儀器

半胱氨酸：揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司；磷酸鹽緩沖液：上海士鋒生物科技有限公司；中性樹膠：上海佳和生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺：北京索萊寶科技有限公司；異硫氰酸熒光素：廣州蕊特生物科技有限公司；辣根過氧化物酶：上海鈺博生物科技有限公司；牛血清白蛋白：上海天承生物科技有限公司；胞流式細(xì)胞儀：江蘇奧凱醫(yī)療設(shè)備有限公司；超低溫冰箱：上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；倒置相差顯微鏡：香港龍達(dá)生物科技有限公司；解剖鏡顯微鏡：上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；電子天平：上海百研生物科技有限公司；封閉血清：上海士鋒生物科技有限公司；掃描電鏡：東莞市協(xié)美電子有限公司。

1.3 方法

將50只大鼠隨機(jī)分為兩組，其中空白對照組10只，實(shí)驗(yàn)組40只?？瞻讓φ战M不做處理，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行噪聲暴露構(gòu)建噪聲性耳聾動物模型[4]，并分為4組，分別為暴露后即刻組和暴露后1 d組、暴露后7 d組、暴露后14 d組，每組各10只。分別收取各組的外周血，檢測各組動物的外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞水平。利用免疫印記法檢測血管內(nèi)皮生長因子，并進(jìn)行組組學(xué)觀察，了解誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和CD34陽性表達(dá)情況[5]。利用掃描電鏡對各組動物進(jìn)行內(nèi)耳掃描，觀察其內(nèi)外毛細(xì)胞排列情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞水平檢測結(jié)果

暴露后即刻組、暴露后1 d組、暴露后7 d組的外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞水平均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但暴露后14 d組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞水平檢測結(jié)果

2.2 各組血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平檢測結(jié)果

暴露后1 d組、暴露后7 d組的血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平均顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但暴露后即刻組、暴露后14 d組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平檢測結(jié)果分析

2.3 實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和CD34表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露后即刻、l d的CD34均呈微弱表達(dá)，噪聲暴露后7 d呈強(qiáng)表達(dá)；噪聲暴露后14 d呈陽性表達(dá)（圖1）。噪聲暴露后即刻誘導(dǎo)型一氧化氮合酶呈微弱表達(dá)，噪聲暴露后1 d呈強(qiáng)表達(dá)，噪聲暴露后7、14 d呈陽性表達(dá)（圖2）。

圖1 實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)型一氧化氮合酶免疫組化（100×）

圖2 實(shí)驗(yàn)組CD34免疫組化（100×）

2.4 各組掃描電鏡觀察結(jié)果

經(jīng)掃描電鏡觀察，空白對照組動物的內(nèi)耳內(nèi)外毛細(xì)胞均呈現(xiàn)出整齊排列的情況（圖3A），暴露后即刻組、暴露后1 d組可見內(nèi)耳毛細(xì)胞呈現(xiàn)出紊亂狀態(tài)（圖3B、C），其中內(nèi)毛細(xì)胞倒伏散亂融和，外毛細(xì)胞倒伏散亂；暴露后7 d組經(jīng)觀察耳蝸第二圈可見外毛細(xì)胞呈現(xiàn)出紊亂缺失情況（圖3D）；暴露后14 d組可觀察到外毛細(xì)胞呈紊亂狀態(tài)，且存在部分缺失現(xiàn)象（圖3E）。

圖3 各組掃描電鏡觀察結(jié)果

3 討論

噪聲是導(dǎo)致聽力殘疾的重要原因之一，主要來源有工業(yè)噪聲、建筑施工噪聲、交通運(yùn)輸噪聲和社會生活噪聲[5]。其中，近年來包括娛樂性噪聲在內(nèi)的社會生活噪聲對聽力的危害最常見。伴隨手機(jī)、平板電腦等電子產(chǎn)品的普及以及歌廳、酒吧等娛樂場所增多，社會公眾特別是青少年因不當(dāng)使用發(fā)生噪聲性聽力損傷的風(fēng)險(xiǎn)日益加大，導(dǎo)致噪聲性耳聾發(fā)病率的不斷上升[6]。噪聲嚴(yán)重危害人體健康。持久的過強(qiáng)的噪聲會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不良的影響，并影響許多器官的活動。噪聲環(huán)境對耳蝸的毛細(xì)胞損傷是積累的，長期的噪聲環(huán)境刺激會造成耳蝸毛細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致耳蝸功能與形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，如耳蝸微音電位振幅的降低，以及掃描電鏡觀察到的耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛排列紊亂等，而且這種損傷是不可逆的[7]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種單層連續(xù)細(xì)胞，覆蓋在血管內(nèi)腔的表面，可以發(fā)揮出一定的血管屏障作用，并具有諸多其他生物學(xué)功能[8-9]。在受損和刺激影響下，血管內(nèi)皮細(xì)胞可以表達(dá)出各種凝血因子，對血液的凝固產(chǎn)生極大的促進(jìn)作用。一定的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞還分泌和釋放出大量的纖溶酶原激活物抑制物，對血栓的溶解產(chǎn)生抑制作用[10]。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以對血管張力予以調(diào)節(jié)，分泌的一氧化氮等物質(zhì)可以使血管發(fā)生平滑肌舒張。且血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)皮素則可以引起血管的有效收縮[11]。于是，通過不同途徑，血管內(nèi)皮細(xì)胞可以對血管的張力以及血流速度等予以不同的調(diào)節(jié)。另外，內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生前列環(huán)素可以對血小板產(chǎn)生作用，發(fā)揮出較強(qiáng)的抗血小板活化作用，并促進(jìn)血管的舒張。血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以合成并表達(dá)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白，達(dá)到抗凝血的目的[12]。血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以合成組織因子途徑抑制物，有效抑制外源性凝血途徑。如果出現(xiàn)血管出血的情況，內(nèi)皮細(xì)胞就會大量釋放內(nèi)皮素，通過收縮血管達(dá)到止血的目的[13]。血管內(nèi)皮一旦受損，會影響血管釋放一氧化氮和內(nèi)皮素，血管的收縮和擴(kuò)張功能就會受影響[14]。

內(nèi)皮祖細(xì)胞來源于骨髓，內(nèi)皮祖細(xì)胞能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，不僅參與人胚胎血管生成，同時也參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。內(nèi)皮祖細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞受損可能與多種疾病發(fā)病密切相關(guān)，這些疾病包括高血壓、冠心病、糖尿病、慢性腎功能衰竭等。內(nèi)皮祖細(xì)胞可以隨著血液在血管內(nèi)流動，可以快速修復(fù)受損的內(nèi)皮，形成功能化內(nèi)皮層，構(gòu)筑天然屏障，降低炎癥發(fā)生概率，并防止血栓形成。如果出現(xiàn)組織缺血損傷的情況，內(nèi)皮祖細(xì)胞便會結(jié)合到血管再生部位，并通過增殖、分化，產(chǎn)生大量的內(nèi)皮細(xì)胞，并積極促進(jìn)局部新生血管形成[15-16]。楊東等[17]對老年性耳聾患者于正常健康老年人外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和增殖集落變化情況等進(jìn)行了檢測和比較發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和增殖集落數(shù)量方面，與正常健康老年人比較，老年性耳聾患者均出現(xiàn)下降的情況，提示人體內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化與老年性耳聾之間具有十分密切的聯(lián)系，可以為其治療和研究提供極大的促進(jìn)作用。而血管再生受到不同生長因子的影響，其中包括血管內(nèi)皮生長因子等[18]。一旦出現(xiàn)組織損傷，便會促使血管內(nèi)皮生長因子和一氧化氮等的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖的積極影響等[19]。王偉等[20]通過構(gòu)建動物模型的方式，分析轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮生長因子基因?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞生長的影響。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮生長因子基因可以對內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長產(chǎn)生十分積極的影響，有效促進(jìn)其增殖能力的提高。

人體內(nèi)耳的聽覺細(xì)胞是一種感受聽覺的纖毛細(xì)胞，易受噪聲影響，損傷后不能再生。長期噪聲刺激使耳蝸血管紋出現(xiàn)血循環(huán)障礙，嚴(yán)重者內(nèi)皮細(xì)胞損傷，繼之螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)生退行性病變，病變部位以耳蝸基底圈末端及第二圈病變最為嚴(yán)重。其中，在毛細(xì)胞損傷過程方面，首先是外毛細(xì)胞受損，其次是內(nèi)毛細(xì)胞。本次研究結(jié)果也顯示，經(jīng)掃描電鏡觀察，空白對照組大鼠的內(nèi)耳內(nèi)外毛細(xì)胞均呈現(xiàn)出整齊排列的情況，而暴露后即刻組、暴露后1 d組可見內(nèi)耳毛細(xì)胞呈現(xiàn)出紊亂狀態(tài)，其中內(nèi)毛細(xì)胞倒伏散亂融和，外毛細(xì)胞倒伏散亂；暴露后7 d組和暴露后14 d組，經(jīng)觀察動物耳蝸第二圈可見外毛細(xì)胞呈現(xiàn)出紊亂、缺失等現(xiàn)象。隨著損傷持續(xù)存在、聽力進(jìn)一步出現(xiàn)其他頻率的下降。在噪聲的影響下，人體耳蝸的血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，血管腔變狹，血液流速減慢，血量減少，導(dǎo)致耳蝸損傷的出現(xiàn)。為此，在對噪聲性耳聾患者進(jìn)行治療的過程中，在修復(fù)耳蝸損傷的時候，可以積極的采取有效措施予以血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)。本研究中，對不同噪聲暴露時間下實(shí)驗(yàn)大鼠的外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞水平和血管內(nèi)皮生長因子、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和CD34水平進(jìn)行檢測，并對空白對照組進(jìn)行比較。研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組暴露后即刻、暴露后1、7 d的外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子水平均顯著高于空白對照組，且經(jīng)免疫組化結(jié)果顯示，噪聲暴露后即刻、l d的CD34均呈微弱表達(dá)，噪聲暴露后7 d呈強(qiáng)表達(dá)，噪聲暴露后14 d呈陽性表達(dá)。噪聲暴露后即刻誘導(dǎo)型一氧化氮合酶呈微弱表達(dá)，噪聲暴露后1 d呈強(qiáng)表達(dá)，噪聲暴露后7、14 d呈陽性表達(dá)。這些表明，在出現(xiàn)耳蝸損傷之后，外周祖細(xì)胞便會由骨髓釋放，并大量進(jìn)入血循環(huán)之中，并積極的參與到耳蝸損傷的修復(fù)之中。通過研究還發(fā)現(xiàn)，到暴露后14 d，實(shí)驗(yàn)組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長因子水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明內(nèi)皮祖細(xì)胞與血管內(nèi)皮生長因子以及CD34的共同作用，可以有效促進(jìn)成熟內(nèi)皮細(xì)胞的分化，從而顯著增加耳蝸新生內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，達(dá)到有效修復(fù)受損序血管的效果。

綜上所述，噪聲性耳聾會導(dǎo)致耳蝸損傷的出現(xiàn)，內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量會隨著時間的變化發(fā)生改變，并在耳蝸損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

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Changes of endothelial Progenitor cells in cochlea of noise deafness

SHI Feng1LI Dongmei2YANG Ruirui3SU Yujing4FEI Xiujing5

1.Department of ENT,Union Hospital of Tangshan City,Hebei Province,Tangshan 063000,China;2.Department of ENT,Occupational Disease Control Institute of Kailuan,Hebei Province,Tangshan 063301,China;3.ICU,Linxi Hospital of Kailuan General Hospital,Hebei Province,Tangshan 063100,China;4.Operation Room,Linxi Hospital of Kailuan General Hospital,Hebei Province,Tangshan 063100,China;5.Department of Surgery,Zhaogezhuang Hospital of Kailuan General Hospital,Hebei Province,Tangshan 063100,China

Objective To explore the changes of endothelial progenitor cells in noise deafness cochlea injure.Methods 50 SD rats were divided into two groups,the blank control group with 10 rats,and the experiment group with 40 rats. Blank control group received no intervention,experiment group exposed to noise and constructed noise deafness animal model,accoding to the exposed time,the rats were divided into four groups,after exposuring immediately group,after exposuring 1 d group,after exposuring 7 d group,after exposuring 14 d group,with 10 rats in each group.The peripheral blood endothelial progenitor cells,blood vascular endothelial growth factor,inducible nitric oxide synthase and CD34 of animals were detected and compared.Results The peripheral blood endothelial progenitor cells in after exposuring immediately group,after exposuring 1 d group and after exposuring 7 d group were higher than that in blank control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);But there was no significant difference between after exposuring 14 d group and blank control group(P＞0.05).The vascular endothelial growth factor expression levels in after exposuring 1 d group,after exposuring 7 d group were higher than that in blank control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);But those in after exposuring immediate group and after exposuring 11 d group were compared with those in blank control group,the differences were not statistically significant(P＞0.05).The result of immunohistochemistry showed:in experiment group,after exposuring immediately and 1 d,expression of CD34 was weak,after exposuring 7 d was strong,after exposuring 14 d was positive;Expression of inducible nitric oxide synthaseafter exposuring immediately was weak,after exposuring 1 d was strong,after exposuring 7,14 d was positive.The results of scanning electron microscopy showed:the inner ear and inner hair cells of animal in the blank control group showed a neatly arranged,inner ear hair cells in after exposuring immediately group and after exposuring 1 d group showed a state of disorder,cochlea second ring visible outer hair cells in after exposuring 7 d group,after exposuring 14 d group showed lack of disorder phenomenon.Conclusion Noise deafness will lead cochlear injury,the number of endothelial progenitor cells will change with the change of time,and it plays an important role in cochlear injury repair.

Noise deafness;Cochlear injury;Endothelial progenitor cells;Changes

R245

A

1673-7210（2015）11（a）-0030-05

2015-06-11本文編輯：蘇 暢）