童陳琦 王 維 梁斌鑫

浙江省人民醫(yī)院藥學部，浙江杭州 310014

二甲雙胍抗腫瘤血管及抑制胃癌細胞生長的實驗研究

童陳琦 王 維 梁斌鑫

浙江省人民醫(yī)院藥學部，浙江杭州 310014

目的探討二甲雙胍對腫瘤血管及胃癌細胞生長的抑制作用。方法利用人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）細胞劃痕試驗、Transwell侵襲實驗、Matrigel血管狀結構形成實驗，研究二甲雙胍對血管內皮細胞侵襲、遷移及血管狀結構形成的影響，且運用流式細胞儀檢測二甲雙胍對血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響；利用胃癌細胞BGC823的MTT實驗、蘇木精凋亡染色、Annexin-Ⅴ細胞凋亡實驗、定量PCR凋亡因子檢測實驗，研究二甲雙胍對胃癌細胞增殖、凋亡的影響。結果二甲雙胍能夠明顯抑制HUVEC的遷移、侵襲、血管狀結構形成，并且明顯減少細胞VEGF的表達；二甲雙胍對胃癌BGC823細胞的增殖有明顯的抑制作用，且具有濃度依賴性，其中最大抑制率為68.80%，半抑制濃度（IC50）為（11.97±1.84）mmol/L；二甲雙胍可以誘導胃癌BGC823細胞凋亡，具有濃度依賴性，10 mmol/L二甲雙胍組凋亡比例接近60%；二甲雙胍組BGC823細胞的Bcl-2 mRNA減少，而AMPKα1、Bax、Bad mRNA的表達增加。結論 二甲雙胍能夠抑制腫瘤血管形成和胃癌細胞增殖，并誘導胃癌細胞凋亡，發(fā)揮抗胃癌細胞生長作用。

二甲雙胍；抗腫瘤；腫瘤血管形成；胃癌

二甲雙胍是雙胍類口服降血糖藥，主要通過活化AMPK通路來減少肝臟糖異生，同時促進脂肪和肌肉組織對葡萄糖的攝取，從而達到降低血糖的目的[1-2]。研究已經(jīng)證實二甲雙胍不僅是一種非常好的糖尿病藥物，還能夠抑制肝癌、子宮內膜癌、乳腺癌、口腔鱗狀細胞癌、肺癌、卵巢癌和腎癌的生長[3-4]。例如根據(jù)發(fā)表在Cancer Prevention Research雜志上的一項新研究提示：在患有糖尿病的非吸煙者中，那些服用糖尿病藥物二甲雙胍的患者患肺癌的風險也明顯降低[5]，但是其作用機制多而復雜，例如二甲雙胍可通過誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，它可以降低結腸癌細胞Bcl-2、Bcl-xl的表達，增加Bax的表達，并且誘導細胞色素C從線粒體釋放進入胞漿，明顯促使caspase-3、PARP活化[6]。此外，有文獻發(fā)現(xiàn)二甲雙胍除能誘導凋亡性細胞死亡和抑制細胞增殖外，還可以抑制腫瘤血管的形成[7]。腫瘤血管為腫瘤的生長提供足夠的營養(yǎng)和養(yǎng)分，也是腫瘤侵襲和轉移所必需的。血管內皮生長因子（VEGF）是血管內皮細胞有絲分裂素，是腫瘤血管新生的一個關鍵調控因子，二甲雙胍可以通過AMPK通路來抑制腫瘤細胞內VEGF的表達，從而達到抑制腫瘤生長的目的。

胃癌是全世界范圍的高發(fā)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，我國胃癌的發(fā)病人數(shù)占到全世界的42%左右，每年發(fā)病40萬例，死亡人數(shù)超過2/3[8]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)胃癌的生長是血管依賴性的，腫瘤直徑達到2 mm時，胃癌的生長就需要新生毛細血管來提供營養(yǎng)和養(yǎng)分[9]。越來越多的研究提示，腫瘤血管與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關，阻斷腫瘤血管新生可以抑制胃癌的生長[10-11]。由于二甲雙胍對胃癌的抑制作用尚不明確，因此，本研究以人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）、胃癌細胞BGC823為研究對象，探討二甲雙胍對血管內皮細胞侵襲、遷移及血管狀結構形成的影響，以及對胃癌細胞增殖、凋亡的影響，為胃癌的臨床預防及治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HUVEC（美國ScienCell公司）；胃癌細胞BGC823（北京協(xié)和細胞庫）；二甲雙胍、MTT、結晶紫染液、蘇木精染液 （Sigma公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（Hyclone公司）；Matrigel膠（BD公司）；VEGF抗體（Bioworld公司）；ECM培養(yǎng)基（美國ScienCell公司）；AV/PI雙染凋亡檢測試劑盒（Mbchem公司）；XDS-1B倒置顯微鏡（重慶重光儀器公司）；Transwell小室（Millipore公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HUVEC加入至完全ECM培養(yǎng)基中，胃癌細胞BGC823培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞劃痕試驗 將HUVEC接種于6孔板中，各組細胞培養(yǎng)24 h待貼壁后，用200 L加樣槍頭在其培養(yǎng)板中劃一直線，并用無血清培養(yǎng)基沖洗刮掉的細胞，形成一無細胞“裸露”區(qū)域[12]，再分別加入含5、10 mmol/L含二甲雙胍的培養(yǎng)基（實驗組）和不加二甲雙胍的培養(yǎng)基（對照組）繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采集圖像，觀察二甲雙胍對血管內皮細胞遷移的影響。

1.2.3 細胞Transwell實驗 制備HUVEC細胞懸液，調整細胞濃度為2.5×105個/mL，取細胞懸液100 μL加入Transwell上層小室，下層加入600 L含10%FBS的ECM培養(yǎng)基。待細胞固定后，加入含5、10 mmol/L二甲雙胍的培養(yǎng)基100 μL，且設置空白對照組。培養(yǎng)細胞24 h，取出小室，PBS清洗后，使用4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色10 min，然后用棉簽擦去上室內的細胞，顯微鏡下采集圖像，觀察二甲雙胍對血管內皮細胞侵襲的影響。

1.2.4 血管狀結構形成實驗 將Matrigel基質膠放于4℃進行解凍，然后均勻鋪在細胞培養(yǎng)板中（每孔50 μL Matrigel）。將鋪完Matrigel基質膠的96孔培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，取HUVEC懸浮細胞，調整濃度為2×105個/mL，每孔加入100 μL，待細胞固定后，加入含5、10 mmol/L二甲雙胍的培養(yǎng)基100 μL，且設置空白對照組。繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)12 h，顯微鏡下觀察微管形成情況。

1.2.5 流式檢測 VEGF表達 在培養(yǎng)板中接種 5× 105個/mL的HUVEC細胞，并且加入5、10 mmol/L二甲雙胍，且設置空白對照組。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化HUVEC細胞，收集細胞，離心并去除培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入VEGF流式抗體孵育30 min，上機檢測VEGF的表達情況。

1.2.6 MTT法測定BGC823細胞增殖 收集對數(shù)生長期的BGC823細胞，離心并去除培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基重懸，以5×103個/孔接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，分別加入0、1.25、2.5、5、10、20、40、60 mmol/L的二甲雙胍，37℃培養(yǎng)72 h后，移除培養(yǎng)基，每孔加入20 μL新配制的含5 mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育4 h后，3000 r/min，離心15 min，去除上清，加入200 μL DMSO，輕度振蕩10 min，用酶標儀在570 nm檢測波長，無參比波長的條件下測定OD值[13]。

1.2.7 蘇木精凋亡染色 將蓋玻片放于培養(yǎng)器皿中，讓培養(yǎng)BGC823細胞長于玻片上，等細胞固定后，加入10 mmol/L二甲雙胍，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出玻片，用4%多聚甲醛固定5 min，然后用蘇木精進行細胞染色，觀察細胞凋亡情況。

1.2.8 Annexin-Ⅴ細胞凋亡檢測 BGC823細胞分別在5、10 mmol/L二甲雙胍中暴露24 h后，收集、離心并去除培養(yǎng)基，然后用PBS洗2次，加入100 μL Binding Buffer和2 μL Annexin-Ⅴ，室溫避光30 min，再加入4 μL PI，避光反應5 min，加入400 μL Binding Buffer，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況[14]。

1.2.9 Real-time PCR檢測凋亡因子 BGC823細胞分別在5、10 mmol/L二甲雙胍中暴露24 h后，采用TRIzol抽提法提取實驗組及對照組細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，流程參照試劑盒說明進行。將2×qPCR Mix（10 μL），模板DNA（1 μL），上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，然后加DEPC水8 μL，混勻后置于qPCR儀中，95℃變性10 min，然后經(jīng)95℃變性30 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)，擴增。最后統(tǒng)計實驗結果，觀察AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad mRNA的表達情況，實驗所涉及基因的引物序列見表1。

表1 Actin、AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad基因的引物序列

2 結果

2.1 二甲雙胍對HUVEC細胞遷移、侵襲的影響

如圖1A所示，與空白對照組比較，5、10 mmol/L二甲雙胍均能抑制人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC的遷移。如圖1B所示，5、10 mmol/L二甲雙胍均能抑制HUVEC細胞的侵襲能力。

圖1 二甲雙胍對HUVEC細胞遷移、侵襲的影響

2.2 二甲雙胍對HUVEC細胞血管狀結構形成的影響

由于HUVEC細胞能在體外Matrigel上形成血管狀結構，可以模擬人體內毛細血管生成的過程，所以，本研究利用HUVEC細胞在Matrigel膠上形成血管樣結構，評價二甲雙胍對血管形成的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)，5、10 mmol/L二甲雙胍均可以明顯抑制內皮細胞血管狀結構的形成（圖2A）。

2.3 二甲雙胍對HUVEC細胞VEGF表達的影響

本研究收集5、10 mmol/L二甲雙胍及空白對照組處理的HUVEC細胞，離心除去培養(yǎng)基后，用PBS清洗2次，然后加入VEGF流式抗體孵育30 min，上機檢測VEGF的表達情況，結果顯示：與空白對照組比較，5、10 mmol/L二甲雙胍均能明顯減少HUVEC細胞中VEGF的表達（圖2B）。

圖2 二甲雙胍對HUVEC細胞血管狀結構形成及VEGF表達量的影響

2.4 二甲雙胍對胃癌BGC823細胞增殖的抑制作用

利用MTT實驗，測得各組細胞的OD值，根據(jù)公式：抑制率=（對照組OD值-給藥組OD值）/對照組OD值×100%，計算出各濃度的抑制率，結果見表2。然后用MicroCal Origin軟件作圖，并且擬合腫瘤細胞生長曲線。結果表明二甲雙胍對胃癌BGC823細胞的增殖有明顯的抑制作用（圖3A），且具有濃度依賴性，最大抑制率為68.80%，半抑制濃度（IC50）為（11.97±1.84）mmol/L。

表2 不同濃度二甲雙胍對胃癌BGC823細胞增殖的影響

2.5 二甲雙胍對胃癌BGC823細胞凋亡的影響

通過細胞爬片、蘇木精染色，發(fā)現(xiàn)加入10 mmol/L二甲雙胍處理的BGC823細胞核染色質致密濃縮，核固縮、深染，提示二甲雙胍能夠直接誘導BGC823細胞凋亡（圖3B）。Annexin V-FITC可標記早期凋亡細胞，而碘化丙啶（PI）能使凋亡中晚期的細胞和死細胞的細胞膜著色。經(jīng)過Annexin V/PI染色結果，本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以誘導胃癌BGC823細胞凋亡，且具有濃度依賴性，10 mmol/L二甲雙胍組凋亡比例接近60%（圖4）。

圖3 二甲雙胍對胃癌BGC823細胞增殖、凋亡的影響

2.6 二甲雙胍對BGC823細胞AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表達的影響

圖4 二甲雙胍對胃癌BGC823細胞凋亡的影響

BGC823細胞經(jīng)過5、10 mmol/L二甲雙胍處理后，提取總RNA，經(jīng)逆轉錄后Real-time PCR檢測AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad mRNA的表達情況，實驗結果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組比較，二甲雙胍組BGC823細胞的Bcl-2 mRNA減少，而AMPKα1、Bax、Bad mRNA的表達增加（圖5）。

3 討論

二甲雙胍具有抗腫瘤的多種生物活性，研究已證實，二甲雙胍能抑制包括乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、卵巢癌、子宮內膜癌及神經(jīng)膠質瘤等多種惡性腫瘤的生長[15]，但對胃癌生長的抑制作用及機制尚不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠抑制腫瘤血管的新生[16-17]，因此本研究首先利用HUVEC在體外研究二甲雙胍對腫瘤血管形成的干預作用，本研究結果初步顯示，二甲雙胍能夠明顯抑制HUVEC的遷移、侵襲。由于Matrigel血管狀結構形成實驗能模擬人體內毛細血管生成的過程，包括內皮細胞出芽增殖和毛細血管網(wǎng)狀結構形成等步驟，接近人體內腫瘤血管生成的實際過程[18]，所以，本研究建立HUVEC體外血管狀結構形成模型，觀察二甲雙胍對血管狀結構形成的影響，結果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以明顯抑制HUVEC血管樣結構的形成，且經(jīng)過二甲雙胍處理的細胞VEGF表達明顯減少，以上結果提示二甲雙胍可以通過AMPK通路來抑制腫瘤細胞內VEGF的表達，抑制腫瘤血管形成，發(fā)揮抗胃癌作用。

圖5 二甲雙胍對AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表達的影響

此外，以往的研究提示二甲雙胍也能夠直接作用于腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞生長。例如研究者發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能激活細胞內AMPK并抑制乳腺癌細胞的增殖[19]，可以誘導多種卵巢癌細胞凋亡[20]。也有研究者表明二甲雙胍可以減少結腸癌細胞Bcl-2、Bcl-xl的表達，增加Bax的表達，促使caspase-3、PARP活化，發(fā)揮誘導癌細胞凋亡作用[6]。但是對胃癌的研究尚不清楚，因此本研究利用MTT實驗，提示二甲雙胍對胃癌BGC823細胞的增殖有明顯的抑制作用，最大抑制率接近70%。蘇木精核染及Annexin V/PI流式凋亡檢測結果均顯示二甲雙胍能夠誘導胃癌BGC823細胞凋亡。實驗通過定量PCR檢測凋亡相關基因Bax、Bad Bcl-2 mRNA證實二甲雙胍可以減少BGC823細胞的Bcl-2，增加Bax、Bad mRNA表達量，且AMPKα1 mRNA表達量的表達量明顯增加，提示二甲雙胍具有直接抑制胃癌細胞增殖、誘導胃癌細胞凋亡的作用，且有可能是通過激活AMPK通路實現(xiàn)的。

綜上所述，糖尿病的一線治療藥物二甲雙胍對腫瘤的多種生物活性已經(jīng)受到研究者們的廣泛關注[21-22]。本研究結果示，二甲雙胍可以通過AMPK通路來抑制腫瘤細胞內VEGF的表達，抑制腫瘤血管形成，也可以直接作用于胃癌細胞，抑制其增殖，并誘導胃癌細胞凋亡，發(fā)揮抗胃癌作用。

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ExPerimental study of Metformin for inhibiting tumor angiogenesis and gastric cancer cell growth

TONG Chenqi WANG Wei LIANG Binxin
Department of Pharmacy,Zhejiang Provincial People's Hospital,Zhejiang Province,Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the inhibiting effect of Metformin on the tumor angiogenesis and gastric cancer cell growth.Methods The cell scratch test,Transwell invasion assay and Matrigel vascular structure formation experiment of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)were used to study the effect of Metformin on vascular endothelial cell migration,invasion and the vascular structure formation,and the influence of Metformin on VEGF expression was illuminated by flow cytometry;then MTT assay,hematoxylin apoptosis of dyeing,Annexin-Ⅴ apoptosis and quantitative PCR detection for apoptosis factors of gastric cancer BGC823 cells were conducted to research the effect of Metformin on gastric cancer cell proliferation and apoptosis.Results Metformin could significantly inhibit endothelial cell migration,invasion,vascular structure of HUVEC,and reduce VEGF expression;Metformin had an obvious inhibiting effect in gastric cancer BGC823 cells proliferation,with the concentration-dependence,the biggest inhibition rate was 68.80%,the 50%inhibiting concentration (IC50)was (11.97±1.84)mmol/L;Metformin could also increase cell apoptosis of BGC823 cells,with the concentration-dependence,the apoptosis rate of 10 mmol/L Metformin was close to 60%;the Bcl-2 mRNA of BGC823 cells treated by Metformin decreased,and the expression of AMPKα1, Bax,Bad mRNA increased.Conclusion Metformin can inhibit gastric cancer growth by inhibiting tumor angiogenesis and gastric cancer cell proliferation,and inducing gastric cancer apoptosis,which plays a role of inhibiting gastric cancer cell growth.

Metformin;Anti-tumor;Tumor angiogenesis;Gastric cancer

R735.7

A

1673-7210（2015）11（a）-0025-06

2015-06-24本文編輯：張瑜杰）

王維（1982.2-），男，碩士研究生；研究方向：中藥藥理和腫瘤藥理學。