林 敏 伍麗娜 夏培生 羅 虹

成都醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，四川成都 610500

戊四氮致癲癇大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)突觸體素、縫隙連接蛋白43、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白表達水平的變化

林 敏 伍麗娜▲夏培生 羅 虹

成都醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，四川成都 610500

目的探討戊四氮致癲癇大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)突觸體素（SYN）、縫隙連接蛋白43（Cx43）以及神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）表達水平的變化。方法 將30只雄性健康SD大鼠隨機分為兩組：對照組（n=15）和實驗組（n= 15）。對照組腹腔注射與戊四氮致癲癇劑量等容量的生理鹽水，實驗組采用戊四氮35 mg/kg連續(xù)腹腔注射28 d后取腦。采用免疫組化染色檢測大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43和GFAP表達的變化，采用Western blot測定大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43含量的變化。結(jié)果免疫組化染色：實驗組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN（0.66±0.06）、Cx43（0.19±0.05）、GFAP（0.61±0.08）的平均吸光度值均高于對照組（0.43±0.05、0.11±0.03、0.36±0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot：實驗組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN（0.26±0.07）、Cx43（0.93±0.07）的表達水平均高于對照組（0.13±0.04、0.61±0.06），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論SYN、Cx43和GFAP的表達水平與癲癇的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，為研究癲癇的病因及發(fā)病機制提供依據(jù)。

癲癇；突觸體素；縫隙連接；星形膠質(zhì)細胞；戊四氮

癲癇是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的腦部慢性綜合征。癲癇與突觸密切相關(guān)，后者可分為化學(xué)突觸和電突觸兩類。突觸體素（synaptophysin，SYN）是一種廣泛分布于突觸前囊泡膜上的鈣結(jié)合酸性糖蛋白，參與了化學(xué)突觸傳遞的過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接為細胞膜上的一種特殊結(jié)構(gòu)，構(gòu)成相鄰細胞間的通訊通道，信息離子及小分子可經(jīng)該通道進行細胞間轉(zhuǎn)運，在神經(jīng)元電活動的維持、神經(jīng)元快速同步化、神經(jīng)元的發(fā)育中起著非常重要的作用[1]。星形膠質(zhì)細胞則通過縫隙連接成為功能合胞體，參與維持神經(jīng)元細胞外環(huán)境的動態(tài)平衡[2]。星形膠質(zhì)細胞大量增生為癲癇病理特點之一，神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）作為星形膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物廣泛應(yīng)用于癲癇發(fā)病機制的研究中。目前，癲癇的發(fā)病機制尚未完全闡明，以上3種物質(zhì)在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程中究竟起著何種作用及三者之間存在怎樣的聯(lián)系一直困擾著筆者。為此，本實驗采用戊四氮（pentetrazole，PTZ）點燃制作慢性癲癇模型，應(yīng)用免疫組化和Western blot的方法觀察SYN、縫隙連接蛋白（connexin，Cx）43和GFAP在大腦皮質(zhì)區(qū)表達的水平變化，并探討SYN、Cx43和GFAP與癲癇的關(guān)系及其在癲癇形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供的健康雄性SD大鼠30只[許可證號：SCXK（川）2013-15]，每只體重控制在（180±20）g。分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～25℃為宜。將其隨機分為對照組（n=15）和實驗組（n= 15）。

1.2 動物模型制備及行為學(xué)觀察

PTZ購于北京精華耀邦醫(yī)藥科技有限公司，用前以生理鹽水新鮮配制成溶液（10 g/L）。實驗組給予PTZ亞驚厥劑量（35 mg/kg）腹腔注射，1次/d，連續(xù)注射28 d，觀察大鼠的行為學(xué)變化。致癲癇的確定采用Racine評分標(biāo)準(zhǔn)，0級：行為上無反應(yīng)；Ⅰ級：節(jié)律性口角和/或面部抽動；Ⅱ級：點頭甩尾或陣攣性咀嚼；Ⅲ級：頭部顫搐伴隨前肢陣攣性抽搐；Ⅳ級：站立并伴雙側(cè)前肢陣攣；Ⅴ級：持續(xù)站立和傾倒，失平衡，四肢抽動。每天對每只大鼠在PTZ注射后監(jiān)測30～60 min，并記錄癲癇發(fā)作的級別、潛伏期（即注射PTZ到首次癲癇發(fā)作所需要的時間）和持續(xù)時間，凡連續(xù)5 d出現(xiàn)Ⅱ級以上癲癇發(fā)作的大鼠均為達到點燃模型標(biāo)準(zhǔn)。對照組用等容生理鹽水代替PTZ腹腔注射。

1.3 取材

實驗組大鼠致癲癇成功后，腹腔注射過量的水合氯醛麻醉大鼠，待大鼠活動減少出現(xiàn)麻醉特征后，將其固定。自左心室插管后剪開右心耳，灌注加入磷酸鹽緩沖液（PBS），直到有澄清液從右心耳流出為止，再灌注4%多聚甲醛1 h。剪開顱骨，取出大腦組織，固定24 h后放入自動脫水包埋機中處理。然后進行修片，連續(xù)切片，片厚5 μm，連續(xù)5張進行貼片、烤片，備用。

1.4 免疫組化染色檢查

采用Envision二步法進行SYN、Cx43和GFAP免疫組化染色。將各組切片置于二甲苯中脫臘，梯度乙醇中水化，0.01 mol/L的PBS液中沖洗（pH=7.2） 3次，3 min/次。高壓熱抗原修復(fù)4 min后再次PBS沖洗。用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。分別滴加SYN抗體（1∶150，武漢博士德生物工程有限公司）或Cx43抗體（1∶150，武漢博士德生物工程有限公司）或GFAP抗體（1∶150，武漢博士德生物工程有限公司），4℃冰箱過夜。復(fù)溫，PBS沖洗3次，滴加兔抗鼠二抗后，置于37℃恒溫箱中孵育60 min。加入DAB-H2O2顯色液，室溫下反應(yīng)，顯微鏡下顯色充分，及時用0.01 mol/L的PBS漂洗；蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。顯微鏡下觀察SYN、Cx43、GFAP的表達，棕黃色反應(yīng)即表示出現(xiàn)陽性結(jié)果。

1.5 Western blot檢測

采用Western blot檢測大腦皮質(zhì)區(qū)SYN和Cx43的含量。實驗組大鼠致癲癇成功后，用過量的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在冰冷的PBS中取出全腦，將皮質(zhì)取出，包于干凈錫紙中，標(biāo)記后投入液氮中浸透，各組標(biāo)本收集齊后從液氮轉(zhuǎn)到-70℃冰箱凍存，準(zhǔn)備好冰盒將皮質(zhì)組織從液氮中取出剪碎后放于預(yù)冷勻漿器中，勻漿的同時加入RIPA蛋白裂解液（含PMSF 100 μmol/L），然后12 000 r/min離心15 min后去除沉淀，BCA蛋白定量后分裝凍存。各電泳道取60 μg樣品上樣后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜。5%BSA中4℃封閉后用一抗（兔抗SYN多克隆抗體1∶400，兔抗Cx43多克隆抗體1∶400，兔抗GAPDH單抗1∶400）孵育2.5 h。然后TBST清洗3次，10 min/次。然后用HRP標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG抗體1∶1000）稀釋，37℃孵育1 h后TBST清洗5次，10 min/次。最后于暗室ECL發(fā)光，經(jīng)過顯影定影后檢測目的條帶。膠片掃描后分析灰度值。

1.6 圖像分析

采用Olympus數(shù)碼照像機采集圖像，每組由外到內(nèi)依次選取10個高倍 （40×10）視野，觀察SYN、Cx43、GFAP陽性產(chǎn)物在大腦皮質(zhì)區(qū)的分布。分別計數(shù)實驗組和對照組在大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43、GFAP的陽性細胞數(shù)量，測量陽性產(chǎn)物的平均吸光度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果

實驗組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43、GFAP平均吸光度值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43、GFAP平均吸光度值比較（）

表1 兩組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43、GFAP平均吸光度值比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；SYN：突觸體素；Cx43：縫隙連接蛋白43；GFAP：神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白

組別 SYN Cx43 GFAP對照組（n=15）實驗組（n=15）0.43±0.05 0.66±0.06*0.11±0.03 0.19±0.05*0.36±0.05 0.61±0.08*

對照組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)偶見淺棕色的SYN陽性細胞，細胞較小，染色淺；實驗組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN陽性細胞的表達顯著增多，且SYN陽性細胞肥大，染色變深。對照組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)見染色程度較弱的Cx43陽性細胞零星出現(xiàn)，Cx43陽性細胞的細胞質(zhì)和細胞膜顯淺棕色；實驗組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Cx43陽性細胞的表達明顯增多，Cx43陽性細胞質(zhì)和細胞膜染色變深，顯深棕色。在光鏡下觀察，對照組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)可見染色程度較弱的GFAP陽性細胞，且陽性表達胞體小，突起細，數(shù)量少；實驗組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)GFAP陽性細胞的表達明顯增多，GFAP陽性細胞肥大，染色變深呈深棕黃色，突起變粗變大，突起之間相互纏繞，連接更為緊密。見圖1。

圖1 兩組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43、GFAP表達情況（免疫組化染色，400×）

2.2 Western blot檢測結(jié)果

實驗組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。兩組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43的Western blot檢測結(jié)果見圖2。

表2 兩組大鼠大腦皮質(zhì)中SYN、Cx43表達水平比較（）

表2 兩組大鼠大腦皮質(zhì)中SYN、Cx43表達水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；SYN：突觸體素；Cx43：縫隙連接蛋白43

組別 SYN Cx43對照組（n=15）實驗組（n=15）0.13±0.04 0.26±0.07*0.61±0.06 0.93±0.07*

圖2 兩組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43表達情況（Western blot）

3 討論

本實驗研究顯示，癲癇狀態(tài)下皮質(zhì)區(qū)SYN免疫反應(yīng)產(chǎn)物密度普遍增加，與Pereno等[3]發(fā)現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)后在未丟失的神經(jīng)元中SYN表達增強的結(jié)果一致。SYN是囊泡膜主要Ca2+結(jié)合位點，參與Ca2+依賴的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程。癲癇發(fā)作時突觸前終末囊泡數(shù)量增加，神經(jīng)元的過度興奮觸發(fā)突觸前膜上電壓門控性Ca2+通道開放，Ca2+大量內(nèi)流，激活Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶系統(tǒng)，促進興奮性氨基酸釋放[4]。興奮性氨基酸在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程中大量蓄積，隨之結(jié)合大量的相應(yīng)興奮性氨基酸受體，使神經(jīng)元異常放電，最終導(dǎo)致癲癇的發(fā)生。此外，通過與突觸前膜Ca2+通道的功能性合作，SYN還促進了抑制性神經(jīng)遞質(zhì)——γ-氨基丁酸（aminobutyric acid，GABA）的非同步釋放[5]。同時檢測到神經(jīng)元細胞外Ca2+濃度持續(xù)增高可以改變神經(jīng)元附近突觸形態(tài)和興奮性[6]，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放頻率也被細胞內(nèi)Ca2+的濃度所控制[7]。由此推測Ca2+從多方面參與SYN釋放遞質(zhì)的過程，可能是癲癇發(fā)生的病理基礎(chǔ)及突觸可塑性的重要分子機制。

作為腦組織中數(shù)量最多的細胞，星形膠質(zhì)細胞存在大量的Cx，其中以Cx43為主[8]，它將星形膠質(zhì)細胞連接成功能合胞體。正常情況下，星形膠質(zhì)細胞間通過縫隙連接介導(dǎo)的細胞間通訊 （gap junctional intercellular communication，GJIC）起著傳播細胞間鈣波及保護神經(jīng)元等重要作用，而在癲癇狀態(tài)下，出現(xiàn)GFAP上調(diào)和Cx43表達及其功能的異常[9]，Cx構(gòu)象的改變可使縫隙連接通道處于開放或關(guān)閉狀態(tài)[10-11]。本研究表明，戊四氮致癲癇大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)SYN、Cx43的表達水平明顯高于對照組（P＜0.05）。Cano-Abad等[12]發(fā)現(xiàn)鈣通道異常使Ca2+過度內(nèi)流，后者引起神經(jīng)元持續(xù)去極化，形成同步性爆發(fā)性放電，導(dǎo)致癲癇的發(fā)生。細胞內(nèi)鈣超載致神經(jīng)元凋亡，膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生，膠質(zhì)細胞間Cx上調(diào)，引起神經(jīng)元膜電位平衡性和穩(wěn)定性紊亂[13]。因此，鈣通道異常引起的神經(jīng)元同步化放電和星形膠質(zhì)細胞增生，Cx43上調(diào)等病理生理過程可能與癲癇密切相關(guān)。Xu等[14]在癲癇大鼠海馬和患者皮質(zhì)中檢測到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signaltransducerandactivatoroftranscription-3，STAT3）與GFAP的共表達，發(fā)現(xiàn)癲癇參與STAT3的激活，后者上調(diào)了GFAP的表達。Geletu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，STAT3是確保GJIC廣泛性的基礎(chǔ)。相反，STAT3的功能需要連接滲透性的維護[16]。因此，推測癲癇參與STAT3的激活，激活后的STAT3增加了縫隙連接間的廣泛性和Cx43的表達，繼而上調(diào)了GFAP的表達。同時，縫隙連接間滲透性的高低又影響STAT3的功能，繼而影響癲癇激活STAT3的過程。神經(jīng)元異常的同步性放電是癲癇發(fā)生的病生理基礎(chǔ)，Beamer等[17]用免疫組化方法檢測了SYN和GFAP，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的活動依靠突觸傳遞與星形膠質(zhì)細胞的增生。

綜上所述，Ca2+既參與了化學(xué)突觸中SYN釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程，又影響了電突觸中縫隙連接管道的開放與關(guān)閉。STAT3則維護了細胞間縫隙連接通訊的廣泛性。兩者都能促進神經(jīng)元的同步活動，加重神經(jīng)元的異常放電，從而參與癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程。因此，對SYN、Cx43和GFAP變化的動態(tài)觀察有助于掌握癲癇的發(fā)展與預(yù)后。

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ExPression level change of SYN,Cx43 and GFAP in rat cerebral cortex after PTZ-induced ePilePsy

LIN Min WU Li'na▲XIA Peisheng LUO Hong
Department of Human Anatomy and Embryology,Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610500,China

Objective To explore expression level change of SYN,Cx43 and GFAP in rat cerebral cortex after PTZ-induced epilepsy.Methods 30 healthy male SD rats were randomly divided into two groups:control group(n=15)and experimental group (n=15).Control group was peritoneal injected with physiological saline,which had similar capacity with PZT.Brain tissues of experimental group were gained after 28 days intraperitoneal injection with PTZ 35 mg/kg every day.Immunohistochemisty was used to detect the expression of SYN,Cx43 and GFAP.Western blot was used to detect the expression of SYN and Cx43.Results Immunohistochemisty:average absorbance values of SYN (0.66±0.06), Cx43 (0.19±0.05),GFAP (0.61±0.08)of rat cerebral cortex in experimental group were higher than those in control group(0.43±0.05,0.11±0.03,0.36±0.05),with statistical differences(P＜0.05).Western blot:expression level of SYN (0.26±0.07),Cx43(0.93±0.07)of rat cerebral cortex in experimental group were higher than those in control group(0.13± 0.04,0.61±0.06),with statistical differences(P＜0.05).Conclusion The expression levels of SYN,Cx43 and GFAP are closely related with occurrence and development of epilepsy,which provides the basis for study of etiology and pathogenesis of epilepsy.

Epilepsy;Synaptophysin;Gap junction;Astrocyte;Pentetrazole

R971

A

1673-7210（2015）11（a）-0013-04

2015-06-08本文編輯：李亞聰）

四川省大學(xué)生創(chuàng)新性實驗項目（201313705023）?！?/p>