牛素生 李 楠 張 燕 劉俊寧 林建華

1.福建中醫(yī)藥大學骨傷學院，福建福州 350122；2.福建醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科，福建福州 350005

龜鹿二仙膠含藥血清誘導大鼠骨髓基質干細胞成骨分化的作用及機制

牛素生1李 楠1張 燕1劉俊寧1林建華2

1.福建中醫(yī)藥大學骨傷學院，福建福州 350122；2.福建醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科，福建福州 350005

目的觀察龜鹿二仙膠含藥血清誘導大鼠骨髓基質干細胞（BMSCs）成骨分化的作用并探討其機制。方法全骨髓貼壁法分離BMSCs，培養(yǎng)至F3代。MTT法檢測龜鹿二仙膠含藥血清增殖作用并確定最佳濃度；F3細胞分為10%FBS組、10%KB組、10%GLEXJ組和Classical組，檢測堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）比活性，茜素紅染色方法觀察對BMSCs成骨分化的作用，RT-PCR方法和Western blot檢測Fzd-2、Axin-2基因和蛋白表達的變化。結果MTT結果顯示濃度為10%的龜鹿二仙膠含藥血清能促進BMSCs增殖；10%GLEXJ組和Classical組ALP比活性高于其余兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且隨著時間的延長，增加更明顯（P＜0.05或P＜0.01），茜素紅染色見橘紅色鈣結節(jié)著色；10%GLEXJ組Fzd-2 mRNA和蛋白表達水平顯著高于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05或P＜0.01）；10%GLEXJ組Axin-2 mRNA和蛋白表達水平顯著低于10%FBS組和10% KB組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論龜鹿二仙膠含藥血清能促進BMSCs增殖并誘導其向成骨細胞分化，其機制可能與增強Fzd-2表達、抑制Axin-2表達和激活Wnt/β-catenin通路密切相關。

龜鹿二仙膠；骨質疏松癥；骨髓基質干細胞；成骨分化

骨質疏松癥是一種以低骨量和容易導致骨折為特征的全身骨代謝疾病。近年來，中醫(yī)藥越來越多應用于骨質疏松癥的防治。龜鹿二仙膠出自《醫(yī)方考·虛損勞瘵門》，臨床常用于骨質疏松癥的治療[1-2]，且無毒副作用[3]。前期研究表明龜鹿二仙膠能增加去卵巢大鼠骨密度和骨強度[4-5]，但其作用機制尚不明確。本實驗通過體外細胞培養(yǎng)觀察龜鹿二仙膠含藥血清對骨髓基質干細胞（BMSCs）向成骨細胞分化的作用并探求其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠65只，其中3月齡60只，體重255～290 g，1月齡5只，體重90～95 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號：SCXK（滬）：2007-0005；合格證號：2007000532861]。

1.1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（BB16/BB5060型；美國Thermo公司）、超微量蛋白核酸酶分析儀（ND-2000C型；美國Thermo公司）、倒置顯微鏡（Olympus IX70；日本Olympus株式會社）、多用電泳儀（DYY-12型；美國Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（GEL DOC2000；美國Bio-Rad公司）、PCR儀（S1000型；美國Bio-Rad公司）、PVDF膜（美國Bio-Rad公司）。

1.1.3 主要試劑 LG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購于美國Hyclone公司；SD大鼠BMSCs成骨誘導分化培養(yǎng)基購于廣州賽業(yè)生物科技有限公司；茜素紅-S粉購于美國Sigma公司；Axin-2、Fzd-2和β-actin兔抗大鼠單克隆蛋白抗體購于美國CST公司；BCA蛋白分析試劑盒購于美國Pierce公司。

1.1.4 實驗藥物 龜鹿二仙膠由鹿角膠6 g、龜甲9 g、枸杞子9 g、人參6 g組成，藥材選用培力藥業(yè)有限公司“農本方”濃縮中藥配方顆粒，各藥物濃縮比例及人與大鼠體表面積換算[6]后的等效劑量見表1。

表1 龜鹿二仙膠藥物組成及劑量

1.2 實驗方法

1.2.1 龜鹿二仙膠含藥血清制備 60只3月齡大鼠從腹腔入路切除雙側卵巢，分為A、B兩組，各30只。術后第二天開始8∶00 am和2∶00 pm灌胃，A組灌服人等效劑量的龜鹿二仙膠[1080 mg/（kg·d）]，B組灌服等容積生理鹽水，連續(xù)7 d。最后一次灌胃2 h后腹主動脈取血，1000 r/min離心15 min后取上層血清并將同組血清混合，56℃水浴滅活，0.22 μm濾器過濾后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BMSCs分離及培養(yǎng) 1月齡SD大鼠斷頸法處死后，75%乙醇浸泡5 min，游離股骨和脛骨并顯露骨髓腔，用含10%胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，200目濾網(wǎng)過濾沖洗液，置于CO2培養(yǎng)箱，記為F1。48 h后首次全量換液，后每2天換液，至細胞融合80%～90%時傳代。首次傳代時，計數(shù)并調整細胞濃度，以1×105個/瓶傳至25 mL培養(yǎng)瓶，后每2天換液，至融合80%～90%時1∶4比例傳代，至F3代。

1.2.3 BMSCs形態(tài)觀察 自F1代開始，倒置顯微鏡每天觀察BMSCs生長情況。

1.2.4 MTT法檢測龜鹿二仙膠含藥血清對BMSCs增殖影響 F3代細胞以4×103個/孔密度傳至96孔培養(yǎng)板，細胞分組及干預條件，見表2。細胞貼壁后血清饑餓24 h，加入相應條件培養(yǎng)基1 d后，每組取8孔，每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT液，37℃孵育4 h，吸除殘余MTT液，每孔加入100 μL的DMSO溶解淡藍色結晶，570 nm波長測OD值，連測8 d，觀察龜鹿二仙膠含藥血清對生長曲線的影響并選擇促進增殖作用最明顯的濃度進行后續(xù)實驗。

表2 F3代細胞分組及干預條件

1.2.5 龜鹿二仙膠含藥血清對BMSCs成骨分化的影響 F3代細胞以1×104個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，將細胞分為10%FBS（LG-DMEM+10%胎牛血清）組、10% KB（LG-DMEM+10%大鼠空白血清）組、10%GLEXJ（LG-DMEM+10%龜鹿二仙膠含藥血清）組和Classical [LG-DMEM+10%胎牛血清+地塞米松（1×10-8mol/L）+ β-甘油磷酸鈉（10 mmol/L）+維生素C（50 mg/L）]組。饑餓24 h后更換條件培養(yǎng)基，每2天全量換液。

1.2.6 堿性磷酸酶（ALP）比活性檢測 細胞培養(yǎng)第7、14、21天后，比色法測細胞培養(yǎng)液ALP活性。按試劑盒操作說明測各管吸光度值，計算各測試管ALP活性。另用紫外分光光度計以595 nm波長測OD值，測定蛋白濃度（mg/L），ALP比活性（U/mg）=ALP濃度/總蛋白濃度。

1.2.7 BMSCs鈣結節(jié)染色 誘導21 d后，PBS洗滌細胞，10%福爾馬林固定45 min，蒸餾水緩慢沖洗2遍，晾干后每孔加入新鮮配制的茜素紅-S染液（pH=4.2）1 mL，37℃遮光孵育30 min，蒸餾水反復沖洗，干燥后顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 RT-PCR法檢測Fzd-2和Axin-2基因的表達 誘導21 d后，Trizol法提取細胞總RNA，測定濃度后取總RNA 1 μg，用Revert Aid TM cDNA第一鏈合成試劑盒，20 μL反應體系逆轉錄為cDNA為PCR模板。PCR反應體系為20 μL，由Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）10 μL、nuclease-free Water 8.2 μL、前后引物各0.4 μL和cDNA 1 μL組成。上海生工生物工程有限公司合成引物，見表3。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，退火，72℃延伸45 s，完成各自循環(huán)后，72℃再延伸10 min。取PCR產物5 μL行瓊脂糖凝膠電泳20 min，以Image Lab 3.0軟件分析圖像，以目的條帶和內參GAPDH的灰度值比值進行分析。

表3 引物及反應條件

1.2.9 Western blot法檢測Fzd-2和Axin-2蛋白的表達 誘導21 d后提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。蛋白變性每孔取20 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳，TBST液洗滌后室溫封閉1 h，加入稀釋后的兔抗大鼠Fzd-2（1∶200）、Axin-2（1∶1000）、β-actin（1∶1000）一抗，4℃搖床過夜后濕式轉膜，TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育1 h。TBST洗滌后將PVDF膜置于顯影墊片，在PVCF膜蛋白面滴加顯影液，1 min后顯影。美國UVP分析儀對膠片掃描，目標蛋白灰度值與β-actin灰度值之比作為目的蛋白表達水平的相對值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs形態(tài)學觀察

3～4 d后可見少許細胞貼壁，呈細長外形，部分有突起。6～8 d后，細胞簇狀生長，10 d左右細胞形態(tài)均一，按一定方向緊密排列，呈典型旋渦狀。傳代細胞增殖快，每5～6天即可鋪滿瓶底。至F3代時，細胞形態(tài)一致，均勻貼壁于瓶底。見圖1。

圖1 F1代培養(yǎng)8 d（200×）

2.2 龜鹿二仙膠含藥血清促進BMSCs增殖和成骨分化

2.2.1 MTT結果 除DMEM組外，其余各組OD值自第2天起即顯著增高，其中10%的GLEXJ組增高明顯，顯著高于其余各組，說明10%濃度的龜鹿二仙膠含藥能促進BMSCs增殖。見圖2。

圖2 龜鹿二仙膠含藥血清對BMSCs增殖作用

2.2.2 ALP比活性的比較 各組細胞ALP比活性隨時間延長而增高，且10%的GLEXJ組和Classical組顯著高于10%的KB組和10%的FBS組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），隨著培養(yǎng)時間的延長，該兩組細胞培養(yǎng)液ALP比活性增加更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），但10%GLEXJ組ALP比活性與Classical比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.2.3 鈣結節(jié)染色 10%FBS組和10%KB組細胞因互相重疊致形態(tài)不規(guī)則，茜素紅染色未見鈣結節(jié)形成。10%GLEXJ組和Classical組細胞密度大，梭形外觀不明顯，細胞重疊，形狀、排列極不規(guī)則，呈明顯的團簇樣聚集，茜素紅染色可見數(shù)個明顯的橘紅色鈣結節(jié)著色（白色箭頭）。見圖4（封三）。

圖3 龜鹿二仙膠含藥血清對ALP比活性的影響

2.3 Fzd-2和Axin-2 mRNA的表達 10%GLEXJ組Fzd-2 mRNA表達水平顯著高于10%FBS組、10%KB組和Classical組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），而10%KB組、10%FBS組和Classical組之間無顯著性差異（P＞0.05）。10%GLEXJ組Axin-2 mRNA的表達水平顯著低于10%FBS組、10%KB組和Classical組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖5。

圖5 龜鹿二仙膠含藥血清對Fzd-2和Axin-2 mRNA表達的影響

2.4 Fzd-2和Axin-2蛋白表達 10%GLEXJ組Fzd-2蛋白表達顯著高于10%FBS組、10%KB組和Classical組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而10% FBS組、10%KB組和Classical組間無顯著性差異；10%GLEXJ組和Classical組Axin-2蛋白水平顯著低于10%FBS組和10%KB組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；10%GLEXJ組Axin-2蛋白表達水平顯著高于Classical組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 龜鹿二仙膠含藥血清對Fzd-2和Axin-2蛋白表達的影響

3 討論

中醫(yī)認為“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨”，腎精和骨之間關系密切。女性絕經(jīng)后腎中精氣衰微致使骨骼失去濡養(yǎng)引起“骨痿不能起于床”、“腰脊不舉”等[7-8]，與現(xiàn)代醫(yī)學中骨質疏松癥臨床表現(xiàn)相似[9-10]，而骨質疏松癥的發(fā)生與BMSCs關系密切。研究表明“補腎”中藥具有“壯骨”功能，推測其與促進BMSCs增殖[11]作用相關。本實驗結果顯示濃度為10%的龜鹿二仙膠含藥血清具有促進BMSCs增殖的作用，說明龜鹿二仙膠增加骨密度的作用與其增強BMSCs增殖有關。

同時，BMSCs可在體內某些因素的作用下向成骨細胞分化，并參與和維持骨的構建過程[12-13]。“補腎”中藥除了能促進BMSCs增殖外，還能誘導其向成骨細胞分化[1-2]。本研究結果顯示龜鹿二仙膠含藥血清組ALP比活性顯著增高，茜素紅染色可見橘紅色鈣結節(jié)形成，表明龜鹿二仙膠含藥血清能誘導BMSCs向成骨細胞分化。而在BMSCs向成骨細胞分化過程中，受多條信號通路[14-16]的調控。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路可通過誘導成骨細胞分化方式促進骨形成[17]，且中藥可通過對該通路相關因子基因和蛋白的表達的影響參與BMSCs成骨分化的過程[18-19]。在Wnt/βcatenin信號通路中，F(xiàn)zd是一種跨膜蛋白，與通路的激活密切相關，而Axin-2與BMSCs成骨分化關系密切，敲除Axin-2基因能增加骨祖細胞、增加成骨標志物表達并能加速骨化[20]。本實驗中龜鹿二仙膠含藥血清誘導BMSCs向成骨細胞分化過程中，F(xiàn)zd-2 mRNA和蛋白表達水平顯著升高，而Axin-2活性受到顯著的抑制。所以，龜鹿二仙膠可通過調控Fzd-2和Axin-2的活性激活Wnt/β-cateinin信號通路促進BMSCs向成骨細胞分化。

綜上所述，龜鹿二仙膠含藥血清能促進BMSCs增殖，同時可通過調控Fzd-2和Axin-2的活性激活Wnt/β-cateinin信號通路誘導其向成骨細胞分化，但由于Wnt信號通路的組成復雜，其機制還需進一步深入研究。

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Effects and mechanisms for Guilu Erxian Glue-containing serum on the osteogenic differentiation of BMSCs

NIU Susheng1LI Nan1ZHANG Yan1LIU Junning1LIN Jianhua2

1.School of Orthopedics and Traumatology,Fujian University of TCM,Fujian Province,Fuzhou 350122,China;2.Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fujian Province,Fuzhou 350005, China

Objective To observe the effect of the Guilu Erxian Glue(GLEXJ)containing serum on the proliferation and the osteogenic differentiation of BMSCs,and try to reveal the mechanism.Methods The BMSCs were isolated by the adherent cell cytopheresis and were expanded to the F3generation,MTT method was used to observe the effects of GLEXJ-containing serum on the proliferation of BMSCs.Then cells were separated to 4 groups,10%FBS group,10%KB group,10%GLEXJ group and Classical group.The ALP activity and the Alizarin Red staining were used to define the osteogenic differentiation of BMSCs.And the mRNA and protein expression of Fzd-2 and Axin-2 were detected by RT-PCR and Western blot method.Results The results of MTT showed that the 10%concentration of GLEXJ-containing serum can stimulate the proliferation of BMSCs.The ALP activity of 10%GLEXJ and Classical group were higher than the other two groups(P＜0.05),and the level was gradually increased in a time-dependent manner(P＜0.05 or P＜0.01);the calcium nodules of orange-red color were observed in the GLEXJ-containing serum group and the Classical group in ARS。The mRNA and protein expression of Fzd-2 in 10%GLEXJ group were higher than the other groups(P＜0.05 or P＜0.01);the mRNA and protein expression of Axin-2 in 10%GLEXJ group were lower than the 10%FBS group and the 10%KB group(P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion The GLEXJ-containing serum can enhance the prolif-eration and the osteogenic differentiation of BMSCs,the possible mechanism is by stimulating the Fzd-2 expression and inhibiting the Axin-2 expression which related with the activity of Wnt/β-catenin pathway.

Guilu Erxian Glue;Osteoporosis;Bone mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation

R285.5

A

1673-7210（2015）11（a）-0008-05

2015-07-12本文編輯：關 婧）

福建省自然科學基金項目（2012J01382）。

牛素生（1979.7-），男，碩士；研究方向：中醫(yī)骨傷科學。

林建華（1955.9-），男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師；研究方向：代謝性骨疾病基礎與臨床。