于鳳賓 岑 蓮 廖新遠 陳德玉

·論著·

山羊硬脊膜的微觀形貌及三維結(jié)構(gòu)特征

于鳳賓 岑 蓮 廖新遠 陳德玉

目的獲取山羊硬脊膜形貌及三維微觀結(jié)構(gòu)特征，為構(gòu)建與之空間結(jié)構(gòu)近似的人工硬脊膜提供相關資料。方法山羊硬脊膜取材后，進行標本處理及大體觀察，光鏡、掃描電鏡及透射電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)、組織學成分、內(nèi)外表面形貌、膠原纖維直徑、分布以及分布模型。結(jié)果大體觀察可見硬脊膜為一乳白色、質(zhì)韌、彈性半透明膜；光鏡下觀察硬脊膜的組成主要由“取向性”結(jié)構(gòu)的膠原纖維及少量散在分布的成纖維細胞組成；掃描電鏡觀察顯示，其內(nèi)外表面如連綿山峰狀隆起；透射電鏡見膠原纖維有序分布，膠原纖維的平均直徑為（627±60）nm，且呈現(xiàn)雙峰分布。結(jié)論山羊硬脊膜是主要由納米級的“取向性”膠原纖維及散在分布的成纖維細胞組成的半透明薄膜。

硬脊膜形貌三維結(jié)構(gòu)

硬脊膜損傷（撕裂或缺損）常見于脊柱外科及神經(jīng)外科，處理不當可引發(fā)一系列并發(fā)癥，嚴重時可危及生命。對于硬脊膜缺損，目前臨床上多采取硬脊膜替代材料進行修補，然而由于現(xiàn)有硬脊膜替代產(chǎn)品均無模仿天然硬脊膜結(jié)構(gòu)的設計理念，雖能成功修復缺損，但不能實現(xiàn)真正意義的硬脊膜再生。因此，有必要明確硬脊膜的空間結(jié)構(gòu)及表觀形貌特征，并以此構(gòu)建與之空間構(gòu)象近似的替代材料，這也是本實驗的目的。實驗山羊硬脊膜表觀形貌和三維結(jié)構(gòu)的獲取主要依靠山羊硬脊膜組織標本的大體觀察、組織學染色光鏡觀察、掃描電鏡及透射電鏡等微觀層面的多角度觀察。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、設備

動物實驗手術(shù)臺（上海醫(yī)療器械廠）；骨科后路減壓手術(shù)器械及眼科手術(shù)器械（上海金鐘醫(yī)療器械廠）；TPl0 20自動脫水機，EGl600包埋機，UL-TRACUTR超薄切片機（萊卡公司，德國）；CM-120透射電鏡荷蘭，XL-30掃描電鏡荷蘭（PHILIPS公司，荷蘭）。

1.2 標本取材

選取成年山羊一頭，臀部注射麻醉藥物速眠新（0.1 mL/Kg）和氯胺酮（6 mg/Kg）行聯(lián)合麻醉。麻醉后，電動脫毛機去除腰背部毛發(fā)，縱向范圍從下胸椎至腰骶部，橫向范圍為正中線至兩側(cè)約10 cm。山羊俯臥位并固定于動物手術(shù)臺，頭架固定頭顱，新潔爾滅消毒液消毒術(shù)區(qū)3遍，鋪無菌手術(shù)單，并以絲線縫合固定術(shù)緣皮膚及手術(shù)單。以L4為中心，作后正中切口，長約8 cm，依次切開皮膚、皮下組織、剝離L3-L5棘突及椎板附著的韌帶、肌肉組織。咬骨鉗咬除L4棘突及全椎板，此時可見硬脊膜表面覆被一層較厚的脂肪組織，用顯微鑷子將椎管內(nèi)脂肪組織清除干凈，暴露硬脊膜囊。于硬脊膜囊正中點用顯微鑷輕輕夾起，避免夾傷脊髓組織，用弧形眼科剪刀剪取0.8 cm×0.5 cm大小硬脊膜缺損，可見清晰的腦脊液從缺損區(qū)流出。

1.3 大體觀察

對切取的硬脊膜標本進行大體觀察。

1.4 組織學觀察

將切取的硬脊膜標本進行脫水、固定、包埋，切成5 μm厚的切片，行HE染色，觀察膠原纖維、細胞分布及排列情況。

1.5 掃描電鏡（SEM）觀察

羊自體硬脊膜標本固定，磷酸緩沖液漂洗，乙醇梯度脫水，乙醇濃度依次為25%、50%、75%、85%、95%和100%，每個濃度脫水5 min，臨界點干燥儀進一步干燥脫水。導電膠固定，噴金，行掃描電鏡觀察，以明確山羊硬脊膜的表觀形貌。

1.6 透射電鏡（TEM）觀察

將硬脊膜標本置于2%戊二醛固定液行預固定（4℃，2 h），磷酸緩沖液沖洗2次，每次10 min，置入1%鋨酸固定液（4℃，2 h），磷酸緩沖液沖洗2次，每次10 min，標本經(jīng)梯度乙醇逐級脫水，每次10 min，環(huán)氧丙烷置換2次，每次10 min，環(huán)氧樹脂812與環(huán)氧丙烷（1∶1）浸透2 h，環(huán)氧樹脂812與環(huán)氧丙烷（2∶1）浸透過夜，純環(huán)氧樹脂812浸透6 h，置60℃烘箱內(nèi)48 h，制備超薄切片，經(jīng)枸櫞酸鉛電子染色后，行TEM觀察。

TEM主要觀察膠原纖維的分布及直徑。采用KS400圖像分析軟件（3.0版，德國）測量膠原纖維橫截面直徑，每組隨機測量100根膠原纖維，計算其平均值和標準差。

2 結(jié)果

2.1 硬脊膜大體觀察

大體觀察可見硬脊膜為一半透明的薄膜，呈乳白色，質(zhì)地較韌，有彈性，切取離體后明顯回縮，內(nèi)表面及外表面（腦脊液側(cè)與背離腦脊液側(cè)）外觀上無明顯差異，表面未見明顯的血管分布。

2.2 組織學觀察結(jié)果

光學顯微鏡下觀察可見硬脊膜主要由膠原纖維及散在分布的成纖維細胞組成，膠原纖維組成纖維束，有“取向性”排列，纖維束并不呈完全線性形態(tài)，而呈波浪形，部分區(qū)域可見由多個密集的纖維絲組成的粗大纖維束，少量的成纖維細胞散在分布于膠原纖維中，主要位于膠原纖維的束與束之間（圖1）。

圖1 山羊硬脊膜組織學觀察（HE染色）Fig.1 Histological observation of goat spinal dural (HE staining)

2.3 SEM觀察結(jié)果

SEM下觀察可見硬脊膜內(nèi)表面（腦脊液面）、外表面（背離腦脊液面）表觀形貌高度相似，并非如肉眼所見的表面那樣光滑平整，而是呈現(xiàn)為膠原纖維構(gòu)成的眾多條索狀隆起，且連綿不斷，極似重巒疊嶂的山峰，膠原纖維束之間可見散在分布的棱形成纖維細胞（圖2）。

圖2 山羊硬脊膜SEM觀察結(jié)果（標尺=20 μm）Fig.2 SEM observation of goat spinal dural(Scale=20 μm)

2.4 TEM觀察結(jié)果

TEM下觀察硬脊膜橫截面圖可見膠原纖維呈圓形或橢圓形，呈規(guī)律性排列?？v切面圖可見膠原纖維呈長條形，呈有序排列，每條膠原纖維中又可見垂直于膠原纖維走向的明暗交替的周期性橫紋（圖3）。膠原纖維的直徑介于400～1 000 nm之間，平均（627±60）nm（圖4）。

圖3 山羊硬脊膜TEM觀察結(jié)果（標尺=500 nm）Fig.3 TEM observation of goat spinal dural(Scale=500 nm)

圖4 羊硬脊膜膠原纖維直徑分布圖Fig.4 The diameter distribution of collagen fibers of goat spinal dural

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)硬脊膜具有不可再生性[1]，硬脊膜缺損后無自我愈合能力，其愈合過程主要依靠其鄰近軟組織而非硬脊膜裂口周緣的成纖維細胞的增生和膠原纖維的沉淀，從而形成瘢痕組織，并與周圍組織發(fā)生嚴重黏連。目前，臨床上對于硬脊膜缺損的治療，大多主張硬脊膜替代材料進行修補，同時輔以密封劑封閉針孔[2]。明膠海綿、膠原蛋白、異體心包或小腸、血管補片、脂肪或筋膜移植和人工合成高分子材料等[3-7]均曾作為硬脊膜替代材料應用于臨床。

本研究發(fā)現(xiàn)硬脊膜主要是由膠原纖維及少量的成纖維細胞組成的半透明薄膜，膠原纖維呈“取向性”排列，成纖維細胞分布于膠原纖維中，微觀下可見硬脊膜內(nèi)外表面呈連綿不斷的山丘狀隆起。而前面提及的所有硬脊膜替代材料均無模仿天然硬脊膜結(jié)構(gòu)的設計理念，故無法實現(xiàn)真正意義的硬脊膜再生。

要想實現(xiàn)硬脊膜的再生，必須先明確硬脊膜的空間結(jié)構(gòu)及表觀形貌特征，并以此構(gòu)建與之空間構(gòu)象近似的替代材料。所以本實驗利用組織學觀察、掃描電鏡及透射電鏡等研究羊硬脊膜正常微觀結(jié)構(gòu)、組織學成分、內(nèi)外表面形貌、膠原纖維直徑和分布以及分布模型，為制備與山羊硬脊膜三維結(jié)構(gòu)相似的硬脊膜再生材料提供相關資料支持。

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Morphology and Three-dimensional Structure Characteristics of Goat Spinal Dural

YU Fengbin1,CEN Lian2,LIAO Xinyuan3,CHEN Deyu3.1 Department of Orthopaedics,98 Hospital of PLA,Huzhou 313000,China;2 School of Chemical Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;3 Department of Spine Surgery, Shanghai Changzheng Hospital,Shanghai 200003,China.Corresponding author:CHEN Deyu(E-mail:deyuchen514@yahoo. com).

ObjectiveTo obtain the morphology and three-dimensional structure characteristics of goat spinal dural and provide information for reconstructing artificial spinal dural.MethodsThe specimens of spinal dural were obtained to observe the microstructure,surface morphology,histology,collagen fiber diameter,distribution and distribution model through naked eyes,light microscope,scanning electron microscope(SEM)and transmission electron microscope(TEM).Results The spinal dura looked like a milky white,translucent,flexible and elastic membrane.It was mainly composed of oriented collagen fibers while fibroblasts line sparsely along those fibers.Its inner and outer surfaces looked like mountain peaks through SEM observation.It was revealed by TEM that collagen fibers distribute orderly with an average diameter of(627±60)nm. The diameters of collagen fibers exhibited a bimodal distribution.ConclusionThe goat spinal dura is a translucent membrane which is mainly composed of nanoscale oriented collagen fibers and sparsely scattered fibroblasts.

Spinal dura;Morphology;Three-dimensional Structure

Q813.1+2

A

1673－0364（2015）05－0289－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.05.001

2015年6月4日；

2015年6月21日）

上海市科委醫(yī)學重點項目（12411950700）。

313000浙江省湖州市中國人民解放軍第九八醫(yī)院骨科（于鳳賓）；200237上海市華東理工大學化工學院（岑蓮）；200003上海市上海長征醫(yī)院脊柱外科（廖新遠，陳德玉）。

陳德玉（E-mail：deyuchen514@yahoo.com）。