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·論著·

疊層自組裝技術(shù)在根面構(gòu)建緩釋系統(tǒng)的研究

張弘岑 蓮?fù)艨?/p>

目的使用疊層自組裝技術(shù)在牙根面構(gòu)建外源性蛋白緩釋系統(tǒng)。方法收集離體下頜第二前磨牙18顆，隨機(jī)分為6組，a-e組為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行酸蝕處理；f組為對照組，不作酸蝕處理。各組在不同條件下進(jìn)行疊層自組裝實(shí)驗(yàn)，于第1～9天收集樣本液，檢測吸光度并計算蛋白釋放濃度。結(jié)果各組樣本蛋白均有持續(xù)性釋放，各組內(nèi)均呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢（P＜0.05）。酸蝕處理組蛋白釋放量顯著高于對照（P＜0.05）；隨著原料中蛋白濃度增加，其釋放量及緩釋速率提高（P＜0.05）；隨吸附次數(shù)的增加，蛋白釋放量也提高（P＜0.05），緩釋速率基本不變，但釋放維持時間延長。結(jié)論疊層自組裝技術(shù)能有效地在根面構(gòu)建外源性蛋白的緩釋系統(tǒng)。

疊層自組裝技術(shù)根面處理緩釋系統(tǒng)蛋白吸附

牙根表面覆蓋有足夠的活性牙周膜細(xì)胞是牙再植成功的關(guān)鍵[1]。研究證實(shí)，根面牙周膜細(xì)胞移植可明顯改善全脫位牙再植的預(yù)后[2-4]。但細(xì)胞移植存在諸多缺點(diǎn)，不利于其臨床轉(zhuǎn)化。隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，通過誘導(dǎo)內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢促進(jìn)組織再生修復(fù)已成為一種新的治療理念，并在多個醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了證實(shí)[5-7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，通過浸泡法，在延時再植的比格犬前磨牙根面加載外源性趨化因子能夠出現(xiàn)一定程度的牙周再生，但再生的成功率并不高[8]。究其原因，可能是由于牙根面很光滑，不利于外源因子的吸附，無法作為趨化因子緩釋載體。為此，本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用疊層自組裝技術(shù)（Layerby-Layer self-assembly technique，LbL）在牙根面構(gòu)建外源性蛋白質(zhì)的緩釋系統(tǒng)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、檸檬酸（生工生物工程股份有限公司），明膠（Sigma，美國），藻酸鈉（Sigma，美國）。紫外-可見吸收光譜儀（BWTEK，美國）。

1.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制濃度為0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1和1.0mg·mL-1的BSA溶液，紫外-可見吸收光譜儀檢測，并記錄280 nm吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 制備根片

收集牙根大小、形態(tài)相似的離體健康下頜第二前磨牙18顆，隨機(jī)分為a～f共6個組，每組3顆。去凈牙周膜并截冠，流動樹脂封閉根管口及根尖孔，透明指甲油封閉截面。

1.4 配制試劑

室溫下配制30%的新鮮檸檬酸。40℃環(huán)境下配制0.1%的明膠溶液，冷卻至室溫。室溫下配制0.1%藻酸鈉溶液，加入BSA，分別配成濃度為0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.5 mg·mL-1的藻酸鈉-BSA溶液。

1.5 LbL吸附實(shí)驗(yàn)

a～e組為實(shí)驗(yàn)組，牙根置于30%檸檬酸中，超聲環(huán)境下浸泡30 min；f組為對照組，牙根置于生理鹽水中，超聲環(huán)境下浸泡30 min。取出牙根，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次。

各組牙根分別浸泡于10 m L 0.1%明膠溶液中，勻速震蕩10 min，PBS沖洗2次，再浸泡于10 m L不同濃度的藻酸鈉-BSA溶液中，靜置10 min，PBS沖洗2次。將此步驟記為1次LbL吸附（表1）。

表1 樣本分組及處理方式Table.1 G rouping and treatment of the specim ens

1.6 檢測BSA釋放量

將上述各組牙根分別置于10 m L生理鹽水中，室溫靜置。分別于1～9 d時收集各組樣本液5 mL，即刻檢測280 nm吸光度，重復(fù)測量3次。計算累積濃度，繪制曲線圖。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組內(nèi)各時間點(diǎn)累積濃度的差異和組間處理因素的差異（根面酸蝕處理、原料BSA濃度、吸附次數(shù)以及是否包覆明膠薄膜）使用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BSA吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

對各濃度生理鹽水-BSA溶液進(jìn)行紫外-可見吸收光譜儀檢測，并記錄280 nm吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 280 nm處生理鹽水-BSA的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of absorbance of saline-BSA at 280 nm

2.2 BSA釋放量

測定各組各時間點(diǎn)對應(yīng)的樣本液累積濃度，結(jié)果顯示各組樣本在實(shí)驗(yàn)時間內(nèi)均有持續(xù)性釋放，其中a、b、c三條曲線在6～7 d后逐漸趨于平緩，而d、e、f三條曲線到9 d時仍能保持相對恒定的釋放速率（圖2）。

圖2 各組樣本隨時間的BSA釋放濃度均值曲線Fig.2 The average curve of BSA release concentration in each sam ple

本實(shí)驗(yàn)各組樣本均呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢（P＜0.05），表明疊層自組裝技術(shù)能夠有效地在牙根表面構(gòu)建外源性蛋白緩釋系統(tǒng)，吸附BSA并持續(xù)性釋放。

BSA釋放濃度均值曲線顯示，曲線d明顯高于曲線f，趨勢分析與組間差異均具有顯著差異（P＜0.05），表明未經(jīng)處理的牙根表面使用LbL技術(shù)也能夠吸附上BSA，但酸蝕處理能夠顯著提高其釋放量。

a、b、c三條曲線走勢相似，趨勢分析與組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明當(dāng)吸附次數(shù)一定（均為2次）時，LbL所用原料中BSA的濃度能夠影響其釋放量，在一定范圍內(nèi)隨濃度增加，釋放量及緩釋速率也提高。

曲線b在6～7 d后趨于平緩，而曲線d在9 d時仍然保持較為恒定的釋放速率，趨勢分析與組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明原料中BSA濃度一定時，隨LbL吸附次數(shù)的增加其釋放量也提高，緩釋速率基本不變，但釋放時間延長。

d、e兩條曲線基本重疊，趨勢分析差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但組間差異無顯著性（P＞0.05），表明在最外層包覆明膠薄膜能夠影響各時間點(diǎn)的BSA釋放量，但不足以對整體釋放水平造成顯著性改變。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次將疊層自組裝技術(shù)應(yīng)用于延時再植牙的研究。該技術(shù)是一種生理多功能性納米薄膜制造技術(shù)[9]，在眾多自組裝方法之中，分子沉積自組裝的應(yīng)用最為廣泛，其原理是使帶有相反電荷的材料（聚陽離子和聚陰離子）交替沉積[10]，常在生物及生物材料領(lǐng)域用于攜帶藥物以達(dá)到緩釋作用。

研究證實(shí)，使用酸蝕劑對牙根面進(jìn)行酸蝕處理能暴露膠原纖維，使根面呈微孔結(jié)構(gòu)[11-12]，這種微觀形貌可提高牙周細(xì)胞對根面的黏附和增殖能力[13]，還可提供天然的支架結(jié)構(gòu)，利于外源性因子的緩釋。此外，酸蝕處理能改善根面的生物相容性，促進(jìn)外源性因子的吸附[11-12]。常見的根面酸蝕處理劑有30%檸檬酸、24%乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）和37%磷酸[14]。其中，30%檸檬酸因其有效的去污能力得到廣泛應(yīng)用[15]。我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以30%檸檬酸在超聲環(huán)境下浸泡30 min能夠簡便有效地暴露根面膠原纖維網(wǎng)，故本實(shí)驗(yàn)中均采用這一方法。其作用機(jī)制可能是經(jīng)酸蝕處理的根面膠原纖維暴露，一方面增加了牙根表面面積，另一方面纖維網(wǎng)中密集的孔隙提供了聚電解質(zhì)吸附的通道，進(jìn)而提高了整個牙根對蛋白質(zhì)的吸附能力。

本實(shí)驗(yàn)使用LbL技術(shù)在根面加載外源性蛋白質(zhì)并檢測其持續(xù)釋放效果。結(jié)果表明，LbL技術(shù)能夠簡便有效地在牙根表面構(gòu)建外源性蛋白的緩釋系統(tǒng)，吸附BSA并達(dá)到緩釋作用，根面酸蝕處理能夠提高蛋白的釋放量，不同的組裝條件也會影響蛋白釋放情況。由于細(xì)胞因子是蛋白質(zhì)類物質(zhì)，故本實(shí)驗(yàn)提供了一種在根面加載細(xì)胞因子的新型方法，但其在延時再植中的具體臨床意義還需細(xì)胞因子吸附實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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Layer-by-layer Self-assembly Coating in the Construction of Sustained Release System on Root Surface

ZHANG Hong1,CEN Lian2,WANG Jun1.
1 Department of Pediatric Dentistry,Shanghai Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 School of Chemical Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China.Corresponding author:WANG Jun(E-mail:wangjun202@hotmail.com).

Objective To construct a sustained release system of exogenous protein on the root surface using layer-by layer self-assembly coating technique.M ethods Eighteen healthy mandibular second premolars were collected and randomly divided into 6 groups,group a-e were experimental groups with acid etching,group f was a control group without etching.Each group went through layer-by-layer adsorption experiments under different conditions.Samp les were collected and detected absorbance on day 1-9 in each group to calculate the concentration of protein release.Results All sets of samples showed sustained-release trend(P＜0.05).Etching group showed a significant increase of protein release compared with control group(P＜0.05);Release rate and amount increased with the protein concentration in the materials(P＜0.05); More adsorption times leaded to larger release amount and prolonged time(P＜0.05).Conclusion Sustained release system of exogenous protein can be constructed on the root surface using layer-by layer self-assembly coating technique.

Layer-by-Layer;Root surface conditioning;Sustained release system;Protein absorption

Q813.1+2

A

1673－0364（2015）03－0121－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.001

2015年4月3日；

2015年5月11日）

上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)項目（124119b0101）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院兒童口腔科（張弘，汪?。?；200237上海市華東理工大學(xué)化工學(xué)院（岑蓮）。

汪?。‥-mail:wangjun202@hotmail.com）。